1、目的：喉癌是危害人類健康和生命的惡性腫瘤，手術及放療為其主要治療手段，但手術后患者喉失去原有的發(fā)音功能，很大程度影響喉癌病人的生活質量及生存率。近年來隨著化療水平的提高，化療在喉癌的綜合治療中越來越占有重要的地位，比如喉癌的新輔助化療，其目的在于縮小腫瘤、使臨床分期提前、與放療或喉部分切除術結合盡可能保留喉的發(fā)音功能。喉癌因位置隱蔽，發(fā)現時往往已到中晚期，晚期喉癌或經手術后出現復發(fā)的患者再次手術較為困難，單純放療只針對局部病灶，難以收到

2、理想的效果，臨床上即給予化療，以控制腫瘤的全身轉移，緩解癥狀，延長生命。 鉑類是頭頸部化療的基礎用藥，以順鉑(cDDP)為基礎的化療在頭頸部腫瘤治療中研究較多，并取得了一定的療效，由于順鉑嚴重的腎毒性和消化道副作用限制了它在臨床的應用，因此開發(fā)高效低毒的鉑類制劑一直是學者們研究的方向。洛鉑是第三代鉑類衍生物，洛鉑以其較輕的毒副作用、與順鉑不完全交叉耐藥以及較強的抗腫瘤活性，已初步顯示了其在腫瘤治療中的重要作用。 本實驗以

3、喉癌細胞株Hep-2為模型，采用倒置顯微鏡、MTT比色法、流式細胞技術檢測洛鉑對喉癌細胞的增殖、周期阻滯、誘導細胞凋亡等作用，應用免疫細胞化學法檢測凋亡相關蛋白bcl-2的表達，初步探討洛鉑對喉癌細胞的增殖抑制、細胞周期改變、誘導細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達等方面的作用，為洛鉑在頭頸部腫瘤化療中的應用提供實驗依據。 方法： 1以對數生長期的喉癌細胞進行實驗，將實驗分組為：①空白對照組(培養(yǎng)液)；②陰性對照組(細胞+培養(yǎng)液)

4、；③實驗組(細胞+不同濃度洛鉑+培養(yǎng)液)；將各組分別培養(yǎng)24、48、72小時。 2倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況及細胞形態(tài)學改變。 3應用MTT比色法檢測洛鉑對喉癌細胞的增殖抑制情況。 4應用流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡率的改變。 5應用免疫細胞化學法(S-P法)檢測bcl-2蛋白表達的變化。 6統計學處理：采用SPSS13.0統計軟件包進行統計學處理。數據分析時先行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布計量

5、資料用均數±標準差(x±s)表示。組間比較先進行方差齊性檢驗，符合方差齊性后采用單因素方差分析的方法進行，如差異有顯著性，進一步LSD法進行兩兩比較。兩樣本均數的比較用t檢驗，顯著性水平以p＜0.05為有統計學意義。 結果： 1相差顯微鏡下每日觀察對照組和各實驗組細胞大小和形態(tài)的變化。陰性對照組Hep-2細胞為上皮樣，貼壁生長于培養(yǎng)基質，輪廓清晰，細胞間結構緊密，生長旺盛。5μmol/L洛鉑作用48h后可見少量細胞體積增

6、大、變圓，仍貼壁生長。20μmol/L時貼壁生長細胞逐漸減少，變圓細胞逐漸增多，脫壁漂浮的小圓球細胞及細胞碎片逐漸增多，到80μmol/L高濃度藥物作用后貼壁生長細胞極少，出現成堆漂浮的死亡細胞及細胞碎片。 2洛鉑對細胞增殖的影響：不同濃度洛鉑在同一時間A值與對照組比較，5μmol/L洛鉑作用24小時與對照組無統計學意義，其余各組與對照組比較差異均有統計學差異(p＜0.05)。同一濃度洛鉑作用24、48、72小時比較差異均有統計

7、學意義(p＜0.05)。洛鉑能明顯抑制喉癌細胞的增殖，抑制率隨著藥物濃度的增加而增加，有劑量依賴關系；抑制率并隨著藥物作用時間的延長而增加，有時間依賴關系。但是到達一定抑制率(80％左右)后，再增加洛鉑藥物濃度，抑制率增加并不明顯，呈現平臺效應。 3.洛鉑對細胞周期的影響：同一濃度洛鉑作用24、48、72小時S期及G0/G1期與對照組比較差異均有統計學意義(p＜0.05)。5μmol/L洛鉑作用24小時開始引起喉癌細胞S期比例增

8、加，隨著作用時間延長到72小時時S期細胞比例下降，G0/G1期細胞比例增加。20μmol/L洛鉑作用24小時使細胞阻滯在S期，阻滯作用明顯，隨著作用時間延長，S期細胞比例下降，隨后出現明顯的G0/G1期阻滯，表明低濃度短時間內使喉癌細胞阻滯在S期，高濃度長時間可使喉癌細胞阻滯在G0/G1期。 4 洛鉑對細胞凋亡率的影響：正常對照組細胞無凋亡峰出現，5μmol/L洛鉑作用24小時后有小的凋亡峰出現，作用48、72小時后出現明顯的凋

9、亡峰，20μmol/L作用24、48小時均出現明顯的凋亡峰。不同濃度洛鉑作用于喉癌細胞24、48、72小時的凋亡率差異均有統計學意義(p＜0.05)，同一濃度洛鉑對喉癌細胞作用24小時、48小時凋亡率差異有統計學意義(p＜0.05)。結果表明洛鉑可以誘導喉癌細胞凋亡，而且隨著藥物濃度和作用時間的增加，凋亡率逐漸增加，洛鉑誘導喉癌細胞的凋亡呈時間和劑量依賴關系，低劑量洛鉑(5μmol/L)24小時即可誘導喉癌細胞出現凋亡。 5 應

10、用免疫細胞化學法(S-P法)檢測各組細胞bcl-2蛋白表達的變化；20μmol/L洛鉑作用48小時后，bcl-2表達減弱，經t檢驗p＜0.05，差異有統計學意義。 結論： 1洛鉑在體外具有抑制喉癌細胞增殖的作用，呈時間和劑量依賴性。 2.洛鉑可以對喉癌細胞產生細胞周期阻滯，低濃度短時間阻滯在S期，高濃度長時間可產生G0/G1期阻滯。 3.洛鉑能誘導喉癌細胞發(fā)生凋亡，呈時間和劑量依賴性，5μmol/L濃度洛