1、急性肝功能衰竭(acuteliverfailureALF)是一種嚴重的臨床綜合征，病情危重，進展迅速，預后兇險，病死率高。目前，唯一有效的治療是原位肝移植。然而，由于供體器官缺乏、圍手術期成本高和手術復雜、需長期使用免疫抑制劑等原因，病人往往在等待供體的過程中由于病情進展而迅速死亡，極大地限制了肝移植手術的廣泛開展。基于此種前提下，生物人工肝支持系統(tǒng)逐步成為治療肝功能衰竭的另一重要手段。生物人工肝能清除患者體內蓄積的各種有害物質，補充必

2、需物質，改善內環(huán)境，暫時替代衰竭肝臟的部分功能，為肝臟再生創(chuàng)造條件，作為通向肝移植的橋梁，降低患者的病亡率，目前已成為僅次于肝移植手術治療肝功能衰竭的最佳治療手段。
　　 生物人工肝的核心為反應器中的肝細胞，生物人工肝對肝功能衰竭患者的肝支持作用幾乎完全依賴于所用肝細胞的生物學功能。通常，肝細胞的生長有賴于血清的存在，在普通培養(yǎng)基中，如不加血清，絕大部分肝細胞不能增值。血清的主要作用在于提供細胞生長增殖所需的激素、生長因子、轉移

3、蛋白和其它營養(yǎng)物質，維持細胞較好的生長狀態(tài)，促進細胞的生長與分裂增殖。然而在生物人工肝的治療過程中，由于反應器中殘留血清的肝細胞與實驗動物或病人血液直接接觸，易引起過敏反應，影響治療效果甚至導致實驗動物死亡。所以，清除生物人工肝中殘留的血清就顯得尤為重要，也是生物人工肝面臨的亟待解決的問題之一。
　　 同時經研究發(fā)現，細胞培養(yǎng)中使用血清還存在著多種缺點:首先，具有批間差異、不同批次血清間的生物活性和因子的不一致，導致產品和實驗結

4、果的重現性差，需要大量驗證工作;其次，血清的來源不穩(wěn)定，成分不明確、有抑制生長的成分、不利于疫苗和單克隆抗體等目的產品的分離純化;最后，存在污染外源病毒和致病因子的風險，容易被病毒和支原體感染。
　　 因此，許多科學家開始進行無血清培養(yǎng)基的研究。無血清培養(yǎng)基是加入成分明確的血清替代成分，既能滿足細胞的培養(yǎng)要求，又能有效避免因使用血清帶來的諸多不利因素。因而無血清培養(yǎng)基得到了越來越普遍的應用，無血清細胞培養(yǎng)技術的研究日益得到人們的

5、重視。
　　 綜上所述，本研究將致力于肝細胞的無血清培養(yǎng)研究。通過無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細胞系，使其與傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)，在細胞數量、活力和功能等方面，達到同樣的效果，從而解決了血清的存在帶來的種種弊端，同時為肝細胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定基礎。具體包括以下兩部分研究內容:
　　 一:一種適合肝細胞生長的無血清培養(yǎng)基;
　　 二:四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細胞的比較研究。
　　 第一部分:一種適

6、合肝細胞生長的無血清培養(yǎng)基
　　 目的:
　　 研發(fā)一種適用于肝細胞(C3A)生長的無血清培養(yǎng)基，為肝細胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定基礎。
　　 方法:
　　 實驗按細胞培養(yǎng)基的不同分為3組:分別為無血清培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基和基礎培養(yǎng)基培養(yǎng);采取逐步降低血清濃度的方法培養(yǎng)C3A細胞，使細胞耐受培養(yǎng)基的改變以及適應無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng);細胞穩(wěn)定后，觀察細胞的生長狀態(tài)，細胞生長曲線和活力曲線觀察，全自

7、動生化分析儀測定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法檢測白蛋白分泌量，實時熒光定量PCR檢測基因水平的變化情況。
　　 結果:
　　 三組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞形態(tài)均正常，細胞生長旺盛，胞漿透亮豐富，貼壁情況良好;細胞在接種24小時后開始增長，隨著時間的推移，細胞數逐漸增多達到最大值后逐漸下降。實驗組與陰性對照組，細胞生長至第五天到達最大值，分別為(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后

8、開始下降;而陽性對照組，細胞生長至第七天達到峰值，為(3.50±0.060)×106。實驗組和陽性對照組的細胞增長速度相近，細胞密度在培養(yǎng)周期內，除第六、七天(p=0.000，p=0.000)以外，無明顯差異(p＞0.05)。而在培養(yǎng)的第三天至第八天，明顯高于陰性對照組(P=0.000);培養(yǎng)的第五天開始，無血清培養(yǎng)基組和完全培養(yǎng)基組的細胞活力無統(tǒng)計學差異(P=0.429)并明顯高于基礎培養(yǎng)基(P＜0.001);無血清培養(yǎng)基組的尿素合成

9、水平在培養(yǎng)的第二天起明顯高于其余兩組(P＜0.001)，而完全培養(yǎng)基組的尿素水平高于基礎培養(yǎng)基組(P＜0.001);三組培養(yǎng)基組的白蛋白分泌量有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，但觀察白蛋白分泌量，三者較為接近，說明無血清培養(yǎng)基能維持較好的細胞功能。Real-timeqPCR顯示，無血清培養(yǎng)基組相對于完全培養(yǎng)基組，UGT、GST、AFP和ALB基因表達量無統(tǒng)計學差異(P=0.640，0.075,0.504,1.000)，而CK18、CK19

10、和HNF4α基因表達量下降(P＜0.001)。
　　 結論:
　　 研制了一種適合于肝細胞(C3A)生長的無血清培養(yǎng)基，其與傳統(tǒng)的血清培養(yǎng)在細胞數量、細胞活力以及細胞功能等方面能達到同樣的效果，為肝細胞用于臨床治療以及生物人工肝走入臨床奠定了基礎。
　　 第二部分:四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)C3A細胞的比較研究
　　 目的:
　　 本研究通過四種無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細胞(C3A)的效果對比，找出最適合于肝

11、細胞的生長，并能最大發(fā)揮肝細胞功能的無血清培養(yǎng)基，為生物人工肝種子細胞的培養(yǎng)、篩選和應用以及生物人工肝走入臨床奠定了基礎。
　　 方法:
　　 實驗按細胞培養(yǎng)基的不同分為6組:分別為A組:HepatoZYME-SFM培養(yǎng)基組;B組:William'sMediumE培養(yǎng)基組;C組:DMEM/F12培養(yǎng)基添加ITS、EGF、Nicotinamide、Asc2P、地塞米松、L-脯氨酸等組分;D組:自主研發(fā)無血清培養(yǎng)基;E組:完

12、全培養(yǎng)基（陽性對照組）;F組:基礎培養(yǎng)基（陰性對照組）:采取逐步降低血清濃度的方法培養(yǎng)C3A細胞，使細胞耐受培養(yǎng)基的改變以及適應無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng);細胞穩(wěn)定后，觀察細胞的生長狀態(tài)，細胞生長曲線和活力曲線觀察，全自動生化分析儀測定上清中ALT漏出量、尿素含量，放射免疫分析法檢測白蛋白分泌量，實時熒光定量PCR檢測基因水平的變化情況。
　　 結果:
　　 六組培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞生長良好，生長曲線觀察，細胞在接種24小時后開始增

13、長，隨著時間的推移，細胞數逐漸增多達到最大值后逐漸下降。A、B、C、D、F組，細胞生長至第五天到達最大值，分別為(1.40±0.060)×106、(2.48±0.041)×106、(3.01±0.050)×106、(2.98±0.032)×106和(1.90±0.091)×106，然后開始下降;而E組細胞生長至第七天達到峰值，為(3.50±0.060)×106。C組細胞在培養(yǎng)初期生長較快，細胞數明顯高于其他組(p＜0.001)，第四天開

14、始，E組的細胞密度超過C組，結果有統(tǒng)計學差異(p=0.000);A組的細胞密度由第三天開始明顯低于其他組(p＜0.001)，且一直保持較低水平，且一直保持較低水平;B、F兩組的細胞密度接近，處于中間水平;D組細胞除第六、七天外，與E組細胞密度無統(tǒng)計學差異(p＞0.05);細胞活力觀察，E組的細胞活力一直保持于最高水平，于培養(yǎng)的前三天明顯高于其他五組(p＜0.001)，由第五天開始，B、F組細胞活力無顯著性差異(p=0.910)而明顯低于

15、其他組(B與A、C、D、E組:p=0.005，0.007，0.000，0.001)，A組細胞活力處于中間水平;C、D兩組的細胞活力處于較高水平，無統(tǒng)計學差異(p＞0.05);細胞功能檢測，ALT漏出量呈現先下降后上升的趨勢。F組的ALT漏出量由第三天開始明顯升高并顯著高于其余五組(P＜0.001)，最高達到(80.000±7.321)IU/L，細胞較早出現損傷;A組的ALT漏出量于第六天開始明顯升高，并顯著高于其余四組(P＜0.001)

16、，最高達到(53.167±2.483)IU/L;B、C、D、E組的ALT漏出量較為接近，一直保持于較低水平，;而尿素檢測結果顯示，D組的尿素分泌量除第一天低于E組(p=0.000)外一直處于最高水平，顯著高于其余5組(P＜0.001);E組的尿素分泌量于培養(yǎng)周期內，明顯高于A、B、C、F四組(P＜0.001);C組的尿素分泌量明顯高于A、B、F三組(P＜0.001)，而低于D、E兩組(P＜0.001);A、B、F三組的尿素分泌量一直處于

17、較低水平;白蛋白結果顯示，D、E兩組的白蛋白的分泌量雖然有顯著性差異(P＜0.001)，但觀察兩組的分泌量，較為接近，且處于較高水平;A、C組的白蛋白分泌量較低;B組的白蛋白分泌量處于中間水平。熒光定量PCR結果顯示:UGT在各組(A、B、C、D、F)中的表達較完全培養(yǎng)基組（E組）都無統(tǒng)計學差異(p=0.774，0.866，0.197，0.877，0.293);GST、ALB的表達除A組(p=0.000，0.000)外，其余各組與完全培

18、養(yǎng)基組均無統(tǒng)計學差異(p＞0.05);AFP的表達在A、B、C、D、E組基本相同(p＞0.05)，而F組顯著低于E組(p=0.041);A、D組的HNF4α表達量均低于完全培養(yǎng)基組(p=0.002，p=0.001)。
　　 結論:
　　 本課題組研制的具有自主知識產權的無血清培養(yǎng)基能通過各種機制在肝細胞培養(yǎng)過程中有效地代替血清成分，細胞生長良好，細胞形態(tài)、密度、活力、功能與含血清培養(yǎng)基基本相同，最適合于肝細胞(C3A)的