1、糖尿病是一種常見的易發(fā)性代謝疾病，其中90%以上為2型糖尿病。胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征，其本質(zhì)是胰島素信號轉導通路中的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)故障。近年來越來越多的證據(jù)表明，活性氧和活性氮介導糖尿病及其并發(fā)癥的病理過程。氧化應激狀態(tài)下NO衍生得到的ONOO-是一個強氧化劑和硝化劑，可與多種生物大分子反應，引起脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和蛋白質(zhì)修飾。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，它與炎癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等多種病癥相關，

2、而ONOO-路徑是導致體內(nèi)蛋白質(zhì)酪氨酸硝化的重要途徑。蛋白質(zhì)酪氨酸硝化能影響蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化，從而影響酪氨酸磷酸化介導的信號轉導通路。研究表明ONOO-與胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關，但ONOO-對胰島素信號轉導通路的調(diào)控作用及其機理尚不完全清楚。
　　 本論文從體外化學體系、細胞培養(yǎng)實驗和體內(nèi)動物實驗三個方面入手，以純化胰島素受體、HepG2細胞和原代骨骼肌細胞、2型糖尿病小鼠模型為研究對象，探討了ONOOˉ對胰島素

3、信號轉導的調(diào)控作用及其機理，所取得的主要結果有：
　　 (1)ONOO-對骨骼肌細胞中胰島素信號分子基因表達的影響
　　 以原代培養(yǎng)骨骼肌細胞為研究對象，采用MTT檢測和實時定量PCR技術研究了化學合成ONOO-和SIN-1對IR/IRSs/PI3-K/Akt通路和IR/CAP/Cbl通路中信號分子基因表達的影響。結果表明，50-1000 μM的ONOOˉ處理顯著減少了骨骼肌細胞中IR、IRS-1、CAP、Cbl和Glu

4、t4的基因表達水平，并具有濃度依賴性。而且，SIN-1濃度依賴地減少了骨骼肌細胞中IR、Cbl和Glut4的基因表達水平，對IRS-1、CAP、p85α和SHIP2的基因表達水平則具有雙向調(diào)節(jié)作用，即低濃度下表現(xiàn)為促進作用，高濃度下表現(xiàn)為抑制作用。以上結果表明較高濃度的ONOOˉ可能下調(diào)IR/IRSs/PI3-K/Akt通路和IR/CAP/Cbl通路中信號分子的基因表達水平，從而抑制骨骼肌細胞中的胰島素信號轉導。
　　 (2)O

5、NOO-對HepG2細胞中胰島素磷酸化信號的影響
　　 以HepG2細胞為研究對象，采用亞細胞分級和Western Blotting技術，研究了ONOOˉ引起的蛋白質(zhì)酪氨酸硝化對胰島素刺激的酪氨酸磷酸化信號的影響，以及硝化蛋白和磷酸化蛋白的亞細胞定位。結果表明ONOOˉ 濃度依賴性地引起了HepG2細胞蛋白質(zhì)的硝化，硝化蛋白主要位于細胞膜和細胞核上。ONOOˉ在低濃度下(10-50 μM)促進膜蛋白和胞質(zhì)蛋白的酪氨酸磷酸化，可能

6、起到信號分子的作用；在高濃度下(100-200 μM)抑制膜蛋白和胞質(zhì)蛋白的磷酸化，可能與胰島素抵抗的發(fā)生有關，提示ONOO-對胰島素信號轉導通路可能具有雙向調(diào)節(jié)作用。
　　 (3)ONOO-對胰島素受體自磷酸化和激酶活性的影響
　　 采用免疫沉淀、免疫印跡、放射配體結合實驗、小鼠血糖測定和實時定量PCR等方法研究了ONOOˉ 在體外和體內(nèi)對胰島素受體自磷酸化和激酶活性的影響。體外實驗結果表明，無論在基礎狀態(tài)下還是在胰島

7、素刺激狀態(tài)下，低濃度的ONOOˉ(50 μM)促進了胰島素受體的自磷酸化和激酶活性，可能作為一個信號分子，而高濃度的ONOOˉ(100-500 μM)抑制了胰島素受體的自磷酸化和激酶活性，可能介導胰島素抵抗的發(fā)生。ONOOˉ的這種雙向調(diào)節(jié)作用可能與它對胰島素受體的硝化和氧化修飾有關。此外，酪氨酸磷酸酯酶活性的降低以及胰島素受體與125I-胰島素結合能力的降低也參與了這一調(diào)節(jié)過程。進一步的體內(nèi)研究表明，腹腔注射0.1 mg/kg和0.25

8、 mg/kg SIN-1顯著降低了正常小鼠的血糖，其作用機理與IR/IRS-1酪氨酸磷酸化水平升高有關。腹腔注射0.25 mg/kg和0.5 mg/kg SIN-1顯著升高了糖尿病小鼠的血糖，其作用機理與IR/IRS-1酪氨酸磷酸化水平降低有關。以上研究結果首次闡明了ONOOˉ 在體外和體內(nèi)如何影響胰島素受體功能，提示ONOOˉ對胰島素受體的自磷酸化和激酶活性具有雙向調(diào)節(jié)作用。
　　 (4)ONOO-在小鼠骨骼肌胰島素抵抗發(fā)生中

9、的作用
　　 采用胰島素耐量測試、免疫沉淀和免疫印跡等方法研究了SIN-1對正常小鼠胰島素敏感性的影響，以及骨骼肌中IR、IRS-1和Akt的硝化和磷酸化。采用高脂飲食誘導胰島素抵抗小鼠模型，檢測骨骼肌中IR和IRS-1的硝化和磷酸化，并觀察了ONOOˉ清除劑FeTPPS對上述效應的干預作用。研究結果表明，正常小鼠腹腔注射10 mg/kg SIN-1后，與空白對照組相比胰島素敏感性顯著降低，骨骼肌中IR、IRS-1和Akt的硝化

10、水平顯著增加，而且在胰島素刺激狀態(tài)下IR、IRS-1和Akt的磷酸化水平顯著降低，這可能是SIN-1導致胰島素敏感性降低的重要原因。此外，SIN-1慢性注射使IRS-1蛋白質(zhì)表達水平顯著降低。在高脂飲食誘導的胰島素抵抗小鼠中，與正常對照組相比骨骼肌中IR和IRS-1硝化水平顯著升高，磷酸化水平顯著降低，胰島素敏感性也顯著降低。使用FeTPPS治療后，與高脂飲食組相比骨骼肌中IR和IRS-1硝化水平顯著降低，磷酸化水平顯著升高，胰島素敏感

11、性也顯著升高。以上研究結果提示IR、IRS-1和Akt的硝化是iNOS介導的胰島素抵抗的一種新的機理。
　　 (5)糖尿病小鼠肝臟和骨骼肌中硝化蛋白質(zhì)組的初步研究
　　 采用免疫沉淀結合SDS-PAGE分離、免疫印跡、膠內(nèi)酶切和LC-ESI-MS/MS等方法鑒定了體外硝化BSA的硝化位點，并探討了2型糖尿病小鼠肝臟和骨骼肌中的蛋白質(zhì)硝化。研究結果表明，BSA發(fā)生硝化的酪氨酸為Tyr161和Tyr424。與正常小鼠相比，糖