1、目的: 將新生Wistar大鼠的睪丸組織塊及其制備的精原干細胞懸液進行同種異體異位移植，了解移植物能否成活及成活后的生長發(fā)育情況，從而為精原干細胞異體異位移植的生長發(fā)育研究以及移植于非免疫缺陷鼠上建立精原細胞移植模型的可行性提供理論依據(jù)。 方法: 1、精原干細胞的制備：取7～9日齡的新生Wistar大鼠，頸椎脫臼法處死。無菌收集雙側(cè)睪丸，置于含適量無血清DMEM/F12培養(yǎng)液的平皿中。用眼科小鑷子仔細去除每個睪丸

2、的脂肪墊、附睪及睪丸白膜，置于試管內(nèi)，加人5ml DMEM/F12培養(yǎng)液，用吸管將精曲小管吹散。室溫靜置3～4 min，棄上清，獲得較為純化的精曲小管。加入I號消化液，33℃水浴振蕩15 min，100次/min．室溫靜置3～4 min，待精曲小管沉降后輕輕吸去上清。然后再加人Ⅱ號消化液，按上述條件消化30 min，可重復(fù)再消化1次。加入含10％小牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌2次，經(jīng)200目300目

3、的細胞篩過濾。從已制備好的每級Percoll梯度液中各取1ml，按密度從大到小依次疊加到10ml離心管中。將待分離的細胞懸液置于梯度最上層，以1400r/min離心，20min。將Percoll溶液第三帶中的細胞小心取出，移至5ml離心管中，加入2ml PBS溶液稀釋Percoll，以1000r/min的速度離心3min，棄上清，重新加入2ml新鮮培養(yǎng)液吹起。取出1滴制備好的細胞懸液，計數(shù)。同時，加入0.4％的臺盼蘭染色，三分鐘內(nèi)，在倒

4、置相差顯微鏡下用血球計數(shù)板分別計算活細胞、死細胞、細胞團的數(shù)目和總細胞數(shù)(鏡下觀察死細胞被染成淡藍色、而活細胞拒染)。 2、同種異體移植取新生雄性Wistar大鼠(7～9天)，切取其睪丸，在含1000u/mL青霉素和1g/l鏈霉素的DMEM/F12中剖開，每個睪丸分成兩半。同時，切除成年雄性(8～12周)Wistar大鼠的雙側(cè)睪丸，形成去勢大鼠。然后，將睪丸組織塊和精原干細胞懸液(細胞濃度4×106個細胞/ml，細胞活力>95％)作為供

5、體，分別植入至作為受體的去勢wistar大鼠的背部皮下，每個受體移植兩個睪丸四塊睪丸組織或1ml精原干細胞懸液。采用隨機法分組，將試驗動物分為A、B兩組。移植精原干細胞懸液的大鼠為A組(n=5)，睪丸組織塊移植的大鼠為B組(n=3)。移植后觀察供體的生長發(fā)育情況。在移植后的第8個星期將受體動物脫頸處死，剪開背部皮膚，從移植部位邊緣用剪刀剪開覆蓋在移植物之上的膜組織，用眼科鑷小心取下移植物。將移植物組織標(biāo)本放入預(yù)冷的Boum液中，置4℃固

6、定24小時，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察生精小管中各種細胞的形態(tài)和組成，同時進行C-kit免疫組化定性分析。 結(jié)論: 1、應(yīng)用組合酶程序消化、Percoll不連續(xù)密度梯度離心，能夠?qū)istar大鼠的精原干細胞進行有效的分離純化。 2、Wistar大鼠精原干細胞懸液異體異位移植于非免疫缺陷鼠中沒有成活，估計可能跟缺少生精微環(huán)境有關(guān)。 3、Wistar大鼠睪丸組織塊異體異位移植于非