1、氯化兩面針堿(nitidine chloride)屬于苯菲啶型生物堿，為黃治勛等[1]從蕓香科花椒屬( Zanthoxylum nitidum(Roxb.)DC.)植物兩面針的干燥根提取的一種生物堿。已有的研究主要是抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙等，關(guān)于抗腫瘤療效也有相關(guān)報(bào)道，如氯化兩面針堿對(duì)慢性細(xì)胞型白血病有較好的臨床療效[1]。而對(duì)肝癌的治療還在實(shí)驗(yàn)研究階段，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道很少。我們從體外一方面研究氯化兩面針堿抗肝癌作用及機(jī)理；另一方面觀察其對(duì)人

2、正常胚肝細(xì)胞、人正常胚腎細(xì)胞增殖抑制作用影響，結(jié)合小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其用藥安全性。 目的： 1通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)考察氯化兩面針堿體外抗肝癌細(xì)胞作用并探討其作用機(jī)制。 2通過(guò)體外氯化兩面針堿對(duì)正常肝腎細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)和小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)，考察氯化兩面針堿用藥安全性。 方法： 1應(yīng)用MTT法研究體外氯化兩面針堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 2應(yīng)用Hoechst熒光染色法及A

3、nnexin V-FITC/PI雙染法等方法研究氯化兩面針堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。 3應(yīng)用免疫組化法研究氯化兩面針堿對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中bcl-2，bax，P53的蛋白表達(dá)；透射電鏡觀察腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。 4通過(guò)酶解可見(jiàn)光底物DEVD-pNp測(cè)定Caspase-3酶活性。 5采用MTT法檢測(cè)對(duì)人胚肝細(xì)胞L-02、人胚腎細(xì)胞293的增殖抑制作用；檢測(cè)用藥前后L-02、293

4、細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)的含量變化。 6通過(guò)小鼠尾靜脈單次注射氯化兩面針堿，觀察所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)并測(cè)定其半數(shù)致死量，評(píng)價(jià)其急性毒性。 結(jié)果： 1在(0.8-12.8)μg/mL的濃度范圍內(nèi)氯化兩面針堿對(duì)人腫瘤細(xì)胞株均有不同程度的增殖抑制作用。氯化兩面針堿對(duì)人腫瘤細(xì)胞株SMMC-7721均表現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒作用并呈劑量依賴(lài)關(guān)系。 2各劑量組(0、2、4、8)μg/m

5、L對(duì)細(xì)胞周期的影響表現(xiàn)為G2/M期阻滯，作用SMMC-772124h后的凋亡指數(shù)分別為(18.9±0.23)％、(23.3±1.54)％、(28.3±3.83)％，明顯高于對(duì)照組(2.0±0.06)％，提示氯化兩面針堿抑制腫瘤細(xì)胞增殖可能與細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。 3免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示：加藥組腫瘤細(xì)胞中bcl-2、bax和P53均有不同程度的表達(dá)，氯化兩面針堿組bcl-2表達(dá)較對(duì)照組組弱，bax表達(dá)較強(qiáng)，而P5

6、3的蛋白表達(dá)也有顯著差異(p<0.01)。電鏡下可見(jiàn)氯化兩面針堿給藥組腫瘤細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮并邊緣化，核碎裂，胞漿空泡化明顯，出現(xiàn)凋亡小體。 4氯化兩面針堿在體外對(duì)人正常胚肝細(xì)胞L-02，人正常胚腎細(xì)胞293的增殖也有一定的抑制作用，且隨藥物劑量的增大，抑制率亦相應(yīng)增大。 5氯化兩面針堿尾靜脈單次給藥的LD50值為其LD50為19.999 mg/kg，LD50的95％平均可信限為(19.999±2.696)mg/kg，LD