1、肝癌惡性程度高，預后差。我國是肝癌的高發(fā)地，全球每年新發(fā)的肝癌病例中45％在我國大陸。其中一個重要原因是我國乙肝病毒攜帶者比例高，具有龐大的肝癌高危發(fā)病人群。目前的各種治療手段仍無法從根本上改變肝癌的預后，亟待研究更為有效的方法用于肝癌的治療。
　　 細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine Induced Killer cells，CIK細胞)是自體外周血單核細胞在體外經多種細胞因子誘導培養(yǎng)產生的一類免疫殺傷細胞。CIK細胞在

2、趨化因子的作用下到達腫瘤部位，可以直接殺傷或通過抗體依賴性細胞介導的細胞毒性效應(antibody dependent cell—mediated cytotoxicity，ADCC)來消滅自體或異體來源的敏感腫瘤細胞，但是單純使用CIK細胞對肝癌患者進行治療，臨床療效并不顯著。
　　 干擾素是由病毒和其他種類的干擾素誘導劑，刺激網狀內皮系統(tǒng)、巨噬細胞、淋巴細胞以及體細胞所產生的一種糖蛋白，主要通過抑制腫瘤病毒的增殖，阻遏癌基因

3、的表達，阻斷腫瘤細胞的分裂，調動機體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞以及誘導腫瘤細胞的分化發(fā)揮抗腫瘤作用。但是干擾素的臨床應用仍存在體內半衰期較短；需大劑量頻繁給藥；全身毒副作用強的問題，從而限制了通過提高劑量而提高療效的方法，其臨床應用具有很多局限性。
　　 本實驗借助于嵌合型腺病毒Ad5()35作為載體將新型高活性干擾素基因TV1導入到CIK細胞內，然后將CIK細胞注射到裸鼠體內。CIK細胞可以靶向腫瘤部位，并在腫瘤部位高效、穩(wěn)定表達干

4、擾素，該方法克服了干擾素治療中由于全身、大劑量和頻繁給藥所帶來的副作用，也克服了單純使用CIK細胞治療效果不佳的缺陷，充分發(fā)揮了基因治療和免疫細胞治療兩者的優(yōu)勢，起到了聯合的抗腫瘤作用。本實驗中所用到的治療基因為新型高活性干擾素TV1(IFN—TV1)基因。IFN—TV1是采用基因穿梭法，由12種人干擾素α基因構建雜交文庫，采用高通量篩選技術，篩選10萬個克隆而得到的高活性新型干擾素，其抗腫瘤作用是目前己上市的國內外同類藥物活性的200

5、～400倍；其抗病毒活性是同類藥物的10倍以上。因其具有廣譜抗腫瘤、抗病毒的作用而成為治療肝癌乃至推遲或防止肝硬化的極佳選擇。
　　 同時基于治療的安全性考慮，本實驗還采用了單純皰疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鳥苷(HSV—TK/GCV)自殺基因系統(tǒng)，將HSV—TK基因插入到攜帶有IFN—TV1基因的腺病毒基因組中，當干擾素表達過量時，向裸鼠體內注射更昔洛韋(GCV)殺死表達干擾素的CIK細胞，從而降低干擾素表達，以防止干擾素表達過量

6、所帶來的副作用，增強治療的安全性。
　　 本實驗主要有以下三部分組成：
　　 一、攜帶IFN—TV1的腺病毒載體的構建和制備
　　 將IFN—TV1基因插入到含有CMV啟動子的腺病毒載體pDC359中得到腺病毒穿梭載體pDC359—TV1，同時將TK基因插入到該載體中得到pDC459—TV1，pDC459—TV1與腺病毒骨架載體pAd5F35共轉染293細胞，10天后出現病毒空斑，經過3次病毒空斑純化，提取病毒基

7、因組進行PCR鑒定，鑒定正確的腺病毒命名為Ad5F35—TV1—TK。經293細胞擴增、氯化銫密度梯度離心純化、TCID50測得病毒Ad5F35—TV1—TK滴度為1．5×1010pfu/ml。
　　 二、表達IFN—TV1的CIK細胞治療肝癌的體外實驗研究
　　 1、分別用Ad5—EGFP、Ad5F11—EGFP和Ad5F35—EGFP感染CIK細胞，比較其感染效率，結果表明與Ad5—EGFP、Ad5F11—EGFP相

8、比，病毒Ad5F35—EGFP對CIK細胞感染效率明顯升高，可以達到90％以上。
　　 2、ELISA方法定量檢測腺病毒Ad5F35—TK—TV1感染CIK細胞后IFN—TV1的表達。根據檢測數據可以看出當MOI=100時，2d、4d、6d和8d測得IFN—TV1的表達量均≥(17．16±4．70)ng達到并超過了IFN—TV1的有效劑量(IFN—TV1的治療劑量為10pg級)。
　　 3、SRB法檢測所表達IFN—TV

9、1的生物活性。結果顯示：當IFN—TV1濃度為1ng/ml時對肝癌細胞株7721和Huh7的抑制率分別為(61．01±12．84)％和(60．74±20．06)％，而對照IFNα—2b濃度為10ng/ml時，其對腫瘤細胞的抑制作用只有(35．70±11．26)％和(30．37±7．80)％，因此病毒Ad5F35—TV1—TK感染CIK細胞后所表達IFN—TV1對肝癌細胞株具有較強的抑制作用且明顯強于對照IFNα—2b。
　　 4

10、、LDH法檢測不同效靶比的CIK細胞和CIK/Ad5F35—TV1—TK(Ad5F35—TV1—TK感染CIK細胞后24h)對肝癌細胞株7721和Huh7的殺傷作用。結果顯示：腺病毒Ad5F35—TV1—TK感染CIK細胞后，CIK/Ad5F35—TV1—TK對肝癌細胞株的殺傷活性顯著增強比單純使用CIK細胞增強了20％以上，說明病毒感染CIK細胞后并未降低CIK細胞的抗腫瘤活性，反而發(fā)揮了聯合的抗腫瘤效應。
　　 5、定量PC

11、R檢測TK基因表達。結果顯示：Ad5F35—TV1—TK與Ad5F35—TV1和空白對照相比，TK基因能夠有效表達。
　　 三、表達IFN—TV1的CIK細胞治療肝癌的體內實驗研究
　　 1、ELISA方法檢測腺病毒Ad5F35—TV1—TK分別感染常氧和低氧條件下培養(yǎng)的CIK細胞經尾靜脈注射到裸鼠體內后1FN—TV1的表達量。當MOI=100時，7d、10d、14d和21d檢測常氧條件下培養(yǎng)的CIK細胞TN1的表達量普

12、遍高于低氧條件下培養(yǎng)的CIK細胞，且其表達量高于治療的有效劑量，達到(248．63±53．90)pg/ml。
　　 2、CIK細胞基因治療系統(tǒng)對裸鼠移植瘤的抑制作用，CIK/Ad5F35—TV1—TK治療組療效明顯優(yōu)于PBS對照組，具有顯著統(tǒng)計學差異(P=0．013)。
　　 3、CIK細胞基因治療系統(tǒng)對荷瘤裸鼠生存期的影響。PBS對照組在治療開始后第28天開始死亡，86天全部死亡。直至對照組小鼠全部死亡時，CIK/Ad

13、5F35—TV1—TK系統(tǒng)治療組裸鼠全部存活。
　　 結論：本課題成功構建了同時攜帶新型高活性IFN—TV1和HSV—TK基因的嵌合型腺病毒Ad5F35—TV1—TK，該病毒能高效感染CIK細胞，從而將治療基因導入CIK細胞內，在體內高效、穩(wěn)定表達IFN—TV1。CIK/Ad5F35—TV1—TK治療系統(tǒng)能顯著抑制裸鼠移植瘤和延長荷瘤裸鼠生存期。該方案綜合了腫瘤的基因治療和細胞治療的雙重優(yōu)勢，彌補了單純細胞治療效果差的不足，也克