1、DNase B是A組乙型溶血性鏈球菌(GAS)的一種分泌蛋白，序列高度保守，幾乎存在于所有GAS中，Anti-DNase B檢測可作為GAS感染引起的疾病的最佳診斷檢測方法。然而DNase B的純化工藝復(fù)雜，獲取成本昂貴，因而無法滿足大量臨床診斷檢測的需要。本課題研究工作的目的在于：通過基因工程的途徑構(gòu)建DNase B原核表達載體，并獲得DNaSe B高效表達。以尋找低成本、大批量的獲得抗原性較強的重組DNaseB的方法，為GAS診斷檢

2、測試劑和疫苗的研制打下堅實的基礎(chǔ)。 本課題研究設(shè)計了獲得重組DNase B蛋白的兩條實驗技術(shù)路線： 實驗技術(shù)路線1：運用PCR技術(shù)，從質(zhì)粒pMOl8一T-DNase B中擴增出0.5 kb截短的ONase B基因片段，將其亞克隆構(gòu)建新的原核表達載體pET-28a(+)-DNase B，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其目的蛋白(約22kd)得到了表達。Western-b10t

3、ting試驗結(jié)果表明：菌體表達的DNase B蛋白能與GAS感染患者的強陽性血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)。但實驗技術(shù)路線1獲得目的蛋白表達量較低。 實驗技術(shù)路線2：采用PCR體外定點突變技術(shù)(PCR-SDM)，對DNase B活性位點的堿基序列進行突變，獲得突變的DNase B基因，TA克隆后測定其核苷酸序列。將其定向克隆入pET-28a(+)載體，構(gòu)建新的原核表達載體，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定正確后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)

4、。表達菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳檢測表明，目的蛋白(約29kd)主要以包涵體形式實現(xiàn)了高效表達。包涵體蛋白用不同濃度的尿素洗滌后，溶解于8mo1/L尿素溶液中，經(jīng)Ni-NTA凝膠親和層析，得到單一的目的蛋白條帶。并且對重組DNase B蛋白進行BCA法定量檢測分析。 我們對DNase B融合蛋白進行了免疫學(xué)試驗。Western-blotting試驗結(jié)果顯示：重組的His-DNase B融合蛋白能夠與GAS感染患者的

5、陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。說明經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測的蛋白就是GAS菌的DNase B蛋白。乳膠凝集試驗結(jié)果顯示：用該蛋白抗原致敏的乳膠顆粒能與GAS感染患者的陽性血清發(fā)生明顯的凝集。ELISA試驗結(jié)果顯示：重組DNase B蛋白的抗原特異性良好。 為了獲得大量的DNase B蛋白，我們對DNase B蛋白表達的發(fā)酵條件進行了正交試驗優(yōu)化。確定DNase B蛋白高效表達的發(fā)酵條件的最佳組合為A2B1C1D3，即接種量2％、誘導(dǎo)