1、目的:
　　 TIPE2(tumor necrosis factor-a induced protein8-like2)是2002年新發(fā)現的一個基因，人TIPE2基因位于染色體1q21.2-1q21.3，由184個氨基酸構成，具有與死亡受體結構域(DED)相似的結構域和6個保守的a螺旋結構。TIPE2與TNFAIP8L1(TIPE1)和TNFAIP8L3(TIPE3)同屬于TNFAIP8家族。研究發(fā)現，TIPE2基因主要表達在胸

2、腺，脾臟，淋巴結以及小腸粘膜等免疫器官和淋巴組織中。進一步研究發(fā)現，將小鼠TIPE2基因敲除后，會導致體重下降，多器官自發(fā)性炎癥，脾腫大，血清學檢測許多炎癥因子如IL-1，IL-6，IL-12，TNF-a等的表達水平均升高。TIPE2基因敲除后小鼠炎癥反應加劇，細胞實驗發(fā)現TIPE2抑制NF-κB信號通路的活化，這些均證明它是一種新型的負性免疫調節(jié)蛋白，在固有免疫反應和適應性免疫反應中均發(fā)揮負性調節(jié)作用。但是，目前關于TIPE2的文獻報

3、道很少，而且主要是通過小鼠模型進行的機制研究，該基因在人類的一些自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡病人(systemic lupus erythematosus， SLE)中的表達及其作用尚無研究。
　　 材料與方法:
　　 1、系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞中TIPE2基因的檢測。
　　 1.1、病例的選擇與標本的收集；
　　 于2008年10月至2009年3月間，從山東大學齊魯醫(yī)院收集剛入院的SLE

4、病例資料，共計39例，全部符合1982年美國風濕病協會(ARA)修訂的SLE的診斷標準，評估SLE的活動指數(systemic lupus erythematosus diseaseactivity index， SLEDAI)為16.33±1.409。同時選取35例年齡和性別匹配的健康獻血者。
　　 1.2、外周血單個核細胞總RNA的抽提及cDNA的制備；
　　 Trizol法抽提外周血單個核細胞總RNA，紫外分光光度

5、計測定RNA的純度及濃度，波長260/280nm處的吸光度(A）值為1.8～2.0時用于實驗，并統一定量為2.0μ9。M-MLV反轉錄酶進行反轉錄制備cDNA。
　　 1.3、半定量RT-PCR及實時熒光定量RT-PCR法檢測TIPE2基因的表達；
　　 根據PubMed中人TIPE2序列(GI：141802951)，根據引物設計的原則，應用Premier Primer5.0引物設計軟件設計引物，為避免基因組DNA的污染

6、，所設計引物均跨不同外顯子。應用半定量RT-PCR及實時熒光定量RT-PCR檢測SLE患者和健康對照者新鮮分離的PBMCs中TIPE2 mRNA的表達。
　　 2.系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞上TIPE2的表達與系統性紅斑狼瘡臨床參數以及MX1的相關性分析。
　　 利用Prism GraphPad軟件對系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞上TIPE2的表達與系統性紅斑狼瘡臨床參數-SLEDA等水平以及MX1的相關性分

7、析。
　　 3.TIPE2的表達和Ⅰ型干擾素之間關系的分析。
　　 3.1、利用TIPE2的SiRNA干擾THP1細胞TIPE2 mRNA的表達；
　　 以脂質體Lipofectamine2000為載體，用針對TIPE2特意靶點的SiRNA轉染入人單核細胞系THP1后，用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測TIPE2，MX1，TNF-amRNA的表達。
　　 3.2、用不同濃度SLE病人的血清刺激THP1細

8、胞；
　　 分別用5％和25％濃度的SLE病人血清與THP1細胞共培養(yǎng)24h，同時用5％和25％濃度的健康人血清做對照，用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測血清刺激24h后THP1細胞中TIPE2和MX1 mRNA的表達水平。
　　 4、地塞米松對TIPE2表達的影響。
　　 在24孔板中，將THP1細胞和分離的正常人外周血PBMC分別以1×106/ml鋪板，加入終濃度為1×10-6mol/L的地塞米松(dexa

9、methason，Dex)，并同時用PBS組作對照，分別刺激2h，12h，24h后，用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測TIPE2 mRNA的表達。
　　 結果：
　　 1、 SLE患者PBMCs中TIPE2和MX1 mRNA的表達及與SLE患者活動指數的相關性分析。
　　 采用實時熒光定量RT-PCR的方法檢測SLE患者和健康對照者PBMC中TIPE2和MX1的mRNA的表達，以2-△△ct表示TIPE2和MX

10、1的表達。結果顯示SLE患者和健康對照者TIPE2的表達值分別為4.207±0.5772和8.620±1.128，SLE患者TIPE2 mRNA的表達水平顯著降低(p=0.0004);SLE患者和健康對照者MX1的表達值分別為44.480±5.400和23.081±4.866，SLE患者MX1 mRNA的表達水平顯著升高(p=0.0.0031)，MX1在SLE患者表達水平升高與文獻報道相符。
　　 2、利用TIPE2的SiRNA

11、干擾THP1細胞TIPE2 mRNA的表達后，MX1和TNF-a mRNA的表達情況
　　 利用半定量RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測針對TIPE2基因特異靶點的SiRNA對THP1細胞表達TIPE2 mRNA的干擾效果，結果表明干擾效率平均達到56.62％;干擾TIPE2 mRNA的表達后，MX1的表達降低，三次結果中，TIPE2干擾率高的與干擾率低的相比，MX1的表達相對增高；TNF-a的表達升高。
　　

12、3、與血清共培養(yǎng)后THP1細胞TIPE2和MX1 mRNA的表達。
　　 5％和25％血清刺激24h后，SLE患者血清組與正常對照組相比TIPE2的表達均有所降低，但是統計學差異不明顯；MX1的表達均升高，且有統計學意義。
　　 4、藥物刺激。
　　 用地塞米松刺激THP1細胞和分離的正常人PBMCs，2h，12h，24h時分別與對照組相比TIPE2的表達均有有升高趨勢，且24h時顯著升高；用IFN-α2a和IF

13、N-α2b刺激THP1細胞，與對照組相比，MX1的表達升高且有統計學意義，TIPE2的表達無顯著變化。
　　 結論：
　　 1、 SLE患者PBMC中TIPE2 mRNA的表達水平與正常對照組相比顯著降低，并且與SLEDAI呈負性相關關系；與已經非常明確的并且在SLE發(fā)病過程中至關重要的IFN-I誘導的基因MX1的表達負性相關。
　　 2、當細胞系THP1中TIPE2表達降低時，MX1的表達降低，TNF-a的表達

14、升高，這提示TIPE2作為TNF-a誘導的表達基因，它表達水平的降低可能反饋性地使TNF-a表達升高。
　　 3、地塞米松作為治療SLE疾病的一種藥物，參與控制SLE發(fā)病過程中對炎癥因子分泌的調控，降低機體的炎癥反應，TIPE2作為免疫系統的負性調控因子，在地塞米松刺激下表達水平升高，參與控制機體的炎癥反應。
　　 綜合結果提示，TIPE2作為一種新發(fā)現的免疫負性調節(jié)因子，它的低表達有可能不能夠有效地對機體進行負性調控，

15、使許多炎癥因子的表達升高，參與SLE病人的發(fā)病進程。TIPE2是新發(fā)現的基因，與疾病的關系尚不清楚，關于TIPE2與人類疾病的研究更少。本研究首先發(fā)現TIPE2在自身免疫性疾病SLE的PBMCs中，表達水平降低，且其降低的水平與疾病的嚴重程度密切相關。SLE發(fā)病機制尚不明確，關于其的治療也有諸多限制。TIPE2作為新發(fā)現的免疫負性調控因子，可能為治療SLE疾病提供新的靶點。
　　 目的：
　　 鋅脂蛋白A20(zinc

16、finger protein A20)是近年來在細胞內源性保護機制的研究中發(fā)現的一類新的蛋白質。A20是體內NF-κB信號系統重要的負反饋調節(jié)因子，也是防止體內炎癥反應失控的重要免疫負反饋調節(jié)蛋白。
　　 方法：
　　 采用實時熒光定量RT-PCR的技術檢測37例系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞鋅脂蛋白A20的表達，同時與同期32例健康者外周血單個核細胞鋅脂蛋白A20的表達做對照進行比較。
　　 結果：

17、　　 系統性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞鋅脂蛋白A20的表達水平較健康對照組明顯降低(p=0.0133)，而且活動期病人與靜止期病人相比A20的表達顯著降低(p=0.0006)，狼瘡腎炎患者與非狼瘡腎炎患者相比表達也顯著降低(p=0.0188)；系統性紅斑狼瘡患者鋅脂蛋白A20的表達水平與系統性紅斑狼瘡患者的活動指數、血沉呈現負相關關系(r=-0.4661，p=0.0036;r=-0.5222，p=0.0009)。
　　 結論