1、柑橘體細胞融合技術有效地克服了柑橘有性雜交過程中遇到的珠心胚干擾、雌雄敗育等生殖障礙,近二十年來已創(chuàng)造了超過250例的不同種間、屬間體細胞雜種材料。由于柑橘體細胞融合實際上是一個半篩選體系,理論上再生植株包括三類:四倍體體細胞雜種,二倍體胞質雜種以及懸浮親本再生植株。而原生質體再生植株很容易產(chǎn)生體細胞無性系變異,因而能創(chuàng)造出一些特別的種質資源。本研究以由‘朋娜臍橙愈傷原生質體’+‘紅橘葉肉原生質體’通過PEG融合后再生的6棵具有果實早期

2、?；Y狀的變異體植株為材料,首先從遺傳背景上分析其來源,而后以朋娜臍橙(Citrussinensis[L.]Osbeck)作為對照分析了兩者果實在發(fā)育過程中細胞壁代謝的變化規(guī)律和相關基因的表達,并采用SSH結合反向Northern技術分析了兩者差異表達的基因。主要研究結果如下:
　　 1.流式細胞儀的倍性測定顯示變異植株均為二倍體,而幾種分子標記,即核SSR,RAPD,cpSSR,mtCAPS和mtRFLP的結果表明,它們的DN

3、A均來源于朋娜臍橙而缺少紅橘的遺傳信息,但在線粒體基因組上單株之間以及與朋娜臍橙都存在著一定程度的變異。而葉型指數(shù)與朋娜沒有顯著差異而與紅橘差異顯著,其中單株之間有差異；枝條與朋娜臍橙相似但其中單株1-3無刺而單株4-6有刺；其花期與朋娜臍橙一致而早于紅橘,花的形態(tài)也與親本不同；果實形態(tài)及生理分析表明其與兩親本有明顯差異,果實表面粗糙,無種子,果實無臍,汁胞?；F(xiàn)象嚴重,果實著色略早,可固、可滴定酸、Vc含量均低于朋娜。由此我們推測其可

4、能是由朋娜臍橙懸浮細胞再生形成的體細胞無性系變異體。
　　 2.測定了不同發(fā)育時期粒化突變體與朋娜臍橙果實汁胞和果皮中果膠類物質和纖維素類物質的組成與含量變化以及相關水解酶類的活性變化。結果表明兩者果皮中果膠類物質以及纖維素類物質沒有顯著差異,但在突變體果實汁胞中原果膠,纖維素,半纖維素,木質素含量顯著高于朋娜臍橙,這些均是細胞壁結構的重要組成物質。其代謝途徑的三個關鍵酶,果膠甲酯酶,多聚半乳糖醛酸酶以及纖維素酶活性在果實發(fā)育過

5、程均明顯低于朋娜臍橙同時期的酶活性,特別是成熟后期。
　　 3.利用Real-timePCR測定粒化突變體與朋娜臍橙果實中細胞壁代謝途徑關鍵酶基因(果膠甲酯酶,多聚半乳糖醛酸酶以及纖維素酶)以及多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白在幾個不同采樣時期的表達。結果與酶活測定結果趨勢一致,表明汁胞粒化與果實中這幾種酶的活動密切相關。綜合以上研究結果,認為?；赡苁怯捎诶w維素代謝相關的基因以及抑制蛋白的表達發(fā)生變化,一方面導致纖維素酶活性變低,使纖

6、維素、半纖維素分解速度減小,另一方面纖維素合成增多,分解速度小于合成速度,導致?；l(fā)生,同時由于果膠酶水解原果膠生成脫甲酯果膠質,其中一部分被鈣橋、酯鍵固定,果膠被凝膠化,進一步加重?；?。
　　 4.為了獲得與?；蛔凅w果實特異性狀相關的基因,我們構建了其與朋娜臍橙果實的抑制性差減文庫(SSH文庫),然后采用反向Northern技術從文庫中篩選在果實發(fā)育過程中差異表達的基因。在對差異表達的基因進行測序以及序列分析后,我們總共得到

7、357條非重復性的基因,64.4％的非冗余序列(207條單一序列與23條contig)。其中與細胞代謝、初生代謝、定位以及大分子代謝等相關的基因數(shù)目最多。這些基因所屬的代謝途徑包括丙酮酸代謝途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、三羧酸代謝途徑及糖酵解代謝途徑等。此外,還對發(fā)現(xiàn)的12個與?；誀羁赡芟嚓P的酶和蛋白候選基因,即果膠甲酯酶抑制蛋白(PMEIP)、果膠酸鹽水解酶(PL)、幾丁質酶(Chitinase)、葡聚糖酶(Glucanase)、β-半

8、乳糖苷酶(Gal)、擴展蛋白(Exp)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、赤霉素調節(jié)蛋白(GRP)、反轉錄轉座子(Retrotransposon)和鈣離子結合蛋白(CaBP),對它們在6個不同發(fā)育時期的基因表達活性變化進行了Real-timePCR檢測,發(fā)現(xiàn)它們也與?；幸欢ǖ年P聯(lián)。
　　 本研究通過對從果實生長發(fā)育的整個階段進行研究,從細胞壁結構物質含量的變化到相關合成及水解酶類的動