膀胱移行細胞癌表達環(huán)氧化酶-2對腫瘤浸潤性樹突狀細胞功能影響的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、膀胱腫瘤是國內泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其中90%以上是膀胱移行細胞癌(BTCC),具有發(fā)病率高、復發(fā)率高等臨床特點。以往的研究認為腫瘤患者存在機體免疫功能低下、腫瘤局部浸潤性樹突狀細胞(TiDC)功能缺陷、腫瘤浸潤淋巴細胞活性及其對腫瘤的殺傷能力下降等現(xiàn)象,認為膀胱局部免疫功能低下可導致殘存腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視并得以生存、發(fā)展,是膀胱腫瘤復發(fā)率高的主要原因,因此提出了腫瘤免疫抑制的“黑洞”理論。樹突狀細胞(dendriticcell,

2、DC)作為機體免疫反應的始動細胞和調節(jié)細胞,具有激活CD8+CTL(細胞毒性T淋巴細胞)和CD4+T輔助細胞的能力,控制著機體內免疫反應的過程,是抗腫瘤免疫的中心環(huán)節(jié)。因此,研究BTCC組織中TiDC功能缺陷的具體機制對膀胱腫瘤治療和預防發(fā)具有重要意義。 環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX)是合成各種前列腺素的關鍵酶。目前認為COX有兩種亞型:即COX-1和COX-2。COX-1屬于組成性酶,在多種組織中表達,參與維

3、持機體正常的生理活動。COX-2是誘導型酶,它可在多種細胞因子的作用下表達上調,參與機體的病理生理過程。研究表明COX-2在許多上皮來源性的惡性腫瘤組織中異常高表達,具有抑制細胞凋亡、降低機體免疫能力、促進腫瘤血管生成等多種功能,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。 目前國內外對COX-2在膀胱腫瘤TiDC功能低下中的作用尚缺乏研究。本實驗在探討COX-2在BTCC中的表達情況前提下,對BTCC表達COX-2與TiDC功能變化之間

4、的相互關系進行了研究,實驗分兩部分進行。 第一部分COX-2在BTCC中的表達及其與BTCC生物學行為的關系目的:探討COX-2在BTCC中的表達及其與BTCC生物學行為的關系。 方法:應用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測10例液氮保存的新鮮BTCC組織和10例腎移植供體正常膀胱組織標本的COX-2mRNA表達情況;采用免疫組織化學方法檢測72例BTCC組織標本和10例腦死亡供者正常膀胱組織標本的COX-2蛋白表達

5、。 結果:10例膀胱癌組織COX-2mRNA均呈陽性表達,10例正常膀胱組織僅有1例COX-2mRNA呈微弱陽性表達,余9例陰性;免疫組織化學顯示正常膀胱組織中未見COX-2蛋白明顯表達,但在BTCC組織中有不同程度的表達,COX-2的表達強度與腫瘤的分級、分期和復發(fā)相關(P<0.05),與腫瘤大小和腫瘤數目無關(P>0.05)。 結論:COX-2在BTCC中呈異常高表達,COX-2的表達強度與腫瘤的分級、分期和復發(fā)等生

6、物學行為相關,提示COX-2可能在BTCC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 第二部分BTCC中的COX-2對腫瘤浸潤性樹突狀細胞表型和功能的影響目的:探討B(tài)TCC表達COX-2對腫瘤微環(huán)境中DC表型和功能的影響,了解其在BTCC免疫逃逸中發(fā)揮的作用,確定COX-2是膀胱腫瘤治療和預防的新靶標,為臨床應用選擇性COX-2抑制劑治療和預防膀胱癌提供理論依據。 方法:1.用RT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法分別檢測T24細

7、胞COX-2mRNA表達情況和其培養(yǎng)上清PGE2水平;觀察COX-2選擇性抑制劑Celebrex在不同濃度、不作用時間對T24細胞COX-2mRNA和PGE2表達的影響。 2.用淋巴細胞分離液梯度離心法分離人外周血單個核細胞,接種于含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中,加入重組人粒巨細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重組人白細胞介素-4(rhIL-4)和T24細胞培養(yǎng)上清(或經celebrex干預的T24細胞培養(yǎng)上清)體

8、外培養(yǎng)DC,以體外正常誘導組作為對照組,于第6天加入腫瘤壞死因子-α(TNF-α)促進DC分化成熟,于第9天收獲各誘導組DC及其培養(yǎng)上清,采用掃描電鏡、流式細胞術、同種異體混合淋巴細胞反應等觀察DC形態(tài)學、表型和功能變化情況,ELISA法測定DC培養(yǎng)上清的IL-12水平。同時用T24細胞凍融抗原負載上述各組誘導培養(yǎng)的第6天DC,48小時后收獲DC并滅活用于刺激T淋巴細胞制備效應細胞(CTL),51Cr釋放試驗測定各組CTL對T24細胞的

9、殺傷活性,ELISA法測定效應細胞培養(yǎng)上清的INF-γ水平。 主要結果:1.T24細胞COX-2mRNA呈陽性表達,其培養(yǎng)上清PGE2濃度為(2058.3±138.0)pg/(2×105cells.ml/24h);Celebrex對T24細胞COX-2mRNA表達水平無明顯影響,Celebrex能有效抑制T24細胞分泌PGE2,60μmol/LCelebrex處理T24細胞24小時后其培養(yǎng)上清中PGE2濃度降至(782.0±69

10、.1)pg/(2×105cells.ml/24h)。 2.光鏡及掃描電鏡顯示各組DC均具有比較典型的樹突狀細胞形態(tài)。與正常對照組相比T24細胞培養(yǎng)上清對DC表面分子CD1a、CD83表達無明顯影響(P>0.05),但MHC-Ⅱ類分子HLA-DR和共刺激分子CD80表達率下調(P<0.01),DC的混合淋巴細胞反應能力和IL-12分泌水平也明顯下降(P<0.01);而且T24細胞上清可使其培養(yǎng)DC誘導的效應細胞分泌INF-γ能力下

11、降(P<0.01),以及降低對T24細胞特異性殺傷活性(P<0.01);外源性PGE2(500pg/ml)與T24細胞培養(yǎng)上清具有類似的效應;而celebrex(60umol/L)處理T24細胞24小時后的培養(yǎng)上清則可阻滯DC的表型和功能抑制現(xiàn)象,但同時直接加入celebrex和T24細胞培養(yǎng)上清與DC共培養(yǎng)則沒有這種阻滯效應。 結論:1.T24細胞培養(yǎng)上清不影響人外周血源性DC的形態(tài)學變化和成熟過程:T24細胞培養(yǎng)上清抑制了D

12、C表面分子HLA-DR和CD80的表達,使DC的抗原提呈能力和活化T細胞能力下調,無法有效誘導抗原特異性CTL反應;同時T24細胞培養(yǎng)上清可使DC分泌IL-12水平明顯下降,使Th1/Th2平衡向Th2漂移,降低IFN-γ的分泌水平,抑制了Th1細胞介導的抗腫瘤免疫效應。 2.上述的DC表型和功能變化是旁分泌PGE2造成的,用COX-2選擇性抑制劑Celebrex減少旁分泌PGE2水平可以阻滯DC表型和功能抑制現(xiàn)象。 全

13、文結論:1.COX-2在BTCC中呈異常高表達,其表達強度與腫瘤的病理分級、臨床分期及復發(fā)有關。 2.COX-2通過PGE2途徑引起膀胱腫瘤微環(huán)境中的TiDC表型和功能缺陷,從而抑制了DC抗原遞呈和誘導機體產生抗腫瘤免疫效應的能力,上述改變是導致膀胱移行細胞癌發(fā)生免疫逃逸的重要機制之一。 3.Celebrex可通過抑制COX-2蛋白活性降低膀胱腫瘤局部微環(huán)境中的PGE2水平,改善TiDC表型和功能,這一結果為我們進一步探

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