1、目的: 通過觀察葛根芩連湯拆方后含黃連各配伍組對葡萄糖-6磷酸脫氫酶（G6PD）缺陷的痢疾桿菌感染（BD）大鼠模型（G6PD-BD）紅細胞滲透脆性的影響，探討黃連配伍對降低紅細胞脆性影響的原因，通過大鼠糞便狀態(tài)的改變比較各配伍組的療效；通過觀察分別灌服葛根芩連湯和黃連大鼠肝臟和腎臟病理切片，考察葛根芩連湯配伍對肝腎毒性的影響；采用高效液相色譜質譜聯(lián)用技術測定葛根、黃連及葛根芩連湯中主要成分犬血中濃度，計算其藥動參數(shù)，探索配伍對主

2、要成分體內(nèi)過程的影響。綜合分析、探討葛根芩連湯的配伍規(guī)律。 1．建立動物模型：先用痢疾桿菌感染大鼠，第二天用乙酰苯肼造成G6PD缺陷，建立實驗性G6PD-BD大鼠模型。 2．隱血實驗：用含黃連的葛根芩連湯各拆方組水煎液給G6PD-BD大鼠灌胃，每天兩次，連續(xù)三天，每天觀察糞便狀態(tài)，第四天腹主動脈取血，測定其始溶血鹽濃度。 3．病理實驗：分別給正常大鼠和G6PD-BD大鼠灌胃高中低劑量的黃連和葛根芩連湯水煎液，每天

3、兩次，連續(xù)三天，第四天麻醉后取其肝臟和腎臟，做病理切片，觀察病理結果。 4．藥動學實驗：建立葛根和黃連主要成分的高效液相色譜質譜檢測方法，測定不同時間點主要成分血清中含量，WinNonlin藥動學軟件計算藥動學參數(shù)。 按處方配比取葛根芩連湯各味藥（葛根24g，黃芩9g，黃連9g，甘草6g）5倍處方量，分別加水2400ml，浸泡15min，先煎葛根20min，余藥共煎30min，煎二次，趁熱用120目濾布濾過，合并濾液，濃

4、縮至360mL，備用。黃連、葛根水煎液同上處理。 分別給不同比格犬葛根、黃連單煎液和葛根芩連湯，不同時間點股靜脈取血，血樣離心（3000r/min）20min，取上清液，乙腈沉淀雜質，渦旋混合器上震蕩5min，離心（3000r/min）20min，取上清液氮氣揮干溶劑，甲醇定容1ml，0．22μm濾膜過濾，得樣品溶液。采用高效液相色譜質譜聯(lián)用儀器（HPLC-MSn）進行分析，色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18（4

5、．6×100mm，1．8um）：流動相A0．02mol/L的醋酸銨水溶液，B為乙腈，梯度洗脫，對葛根主要成分進行含量測定；流動相A0．2%三乙胺的水溶液（調pH值為6），B為乙腈，梯度洗脫，對黃連主要成分進行含量測定。 結果: 1．G6PD-BD大鼠具有體青、體涼，便黑，立毛現(xiàn)象，大便量多、稀、出現(xiàn)白膜，結果顯示造模成功。 2．隱血實驗表明，單味黃連能使G6PD-BD大鼠紅細胞滲透脆性增加，黃連配伍葛根、黃芩、炙

6、甘草后均能降低紅細胞滲透脆性，其中葛根芩連湯全方和黃連、黃芩、葛根配伍組能使紅細胞滲透脆性恢復到正常水平。通過對大鼠糞便狀態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)給予葛根芩連湯、黃連葛根甘草、黃連葛根的大鼠第二天糞便恢復正常狀態(tài)，給予其他配伍組的大鼠第三天才恢復正常狀態(tài)。 3．分別給G6PD-BD大鼠和正常大鼠高、中、低劑量的單味黃連和葛根芩連湯全方，比較其肝臟腎臟病理切片，模型組給藥后腎臟充血比較：高劑量黃連>中劑量黃連=低劑量黃連，高劑量葛根芩連湯>中

7、劑量葛根芩連湯=低劑量葛根芩連湯；正常組給藥后腎臟充血情況比較：高劑量黃連>中劑量黃連>低劑量黃連。模型組和正常組給藥肝臟充血情況比較：高劑量黃連=中劑量黃連>低劑量黃連；模型組給藥肝臟水腫情況比較：高劑量黃連>中劑量黃連≥低劑量黃連，高劑量葛根芩連湯>中劑量葛根芩連湯=低劑量葛根芩連湯；正常組給藥肝臟水腫情況比較：高劑量黃連>中劑量黃連≥低劑量黃連，中劑量葛根芩連湯>低劑量葛根芩連湯>高劑量葛根芩連湯。 4．主要成分采用藥動學

8、WinNonlin軟件處理后結果如下： （1）葛根芩連湯與單味葛根中主要成分藥動參數(shù)變化對比： ①葛根素：AUC比葛根大，CL比葛根慢，t1/2較葛根快，Tmax較葛根慢，Cmax較葛根高；②大豆苷：AUC比葛根大，CL比葛根快，t1/2較葛根慢，Tmax較葛根快，Cmax較葛根高；③大豆苷元：AUC較葛根大，CL比葛根慢，t1/2較葛根快，Tmax和全方一致，Cmax較葛根高。 葛根及葛根芩連湯中沒有標準品對照

9、的成分（物質A），血中產(chǎn)生代謝產(chǎn)物（物質B）；④物質A：AUC比葛根大，CL比葛根快，t1/2較葛根快，Tmax較葛根快，Cmax較葛根高；⑤物質B：AUC比葛根小，CL比葛根慢，t1/2較葛根快，Tmax較葛根快，Cmax較葛根高。 （2）葛根芩連湯與單味黃連中主要成分藥動參數(shù)對比： ①鹽酸小檗堿：AUC比黃連小，CL比黃連高，t1/2較黃連慢，Tmax比黃連快，Cmax較黃連低；②巴馬?。篈UC比黃連小，CL比黃連高

10、，t1/2較黃連快，Tmax較黃連慢，Cmax較黃連低；③黃連堿：AUC較黃連小，CL比黃連高，t1/2較黃連慢，Tmax較黃連快，Cmax比黃連低。 結論: 1．黃連配伍葛根炙甘草、葛根、黃芩炙甘草、黃芩、炙甘草均能拮抗單味黃連對紅細胞滲透脆性的影響：葛根芩連湯、葛根黃連黃芩三藥配伍對G6PD-BD大鼠紅細胞滲透脆性無影響；說明葛根芩連湯通過配伍能減低黃連對紅細胞滲透脆性的影響。糞便狀態(tài)的改變初步說明葛根芩連湯、黃連葛

11、根甘草、黃連葛根配伍組的療效優(yōu)于單味黃連。 2．在機體正常狀態(tài)下給單味黃連和葛根芩連湯對腎臟和肝臟的毒性作用要大于在病理狀態(tài)下的，結果提示在治療疾病的情況下灌服單味黃連或葛根芩連湯全方對肝腎是安全的；在黃連同等劑量下單味黃連和葛根芩連湯對肝腎切片結果對比提示，單味黃連的毒性大于葛根芩連湯全方；中高劑量的單味黃連和葛根芩連湯能對肝臟產(chǎn)生一定的毒性，對腎臟的毒性小于肝臟。 3．葛根芩連湯及單味葛根中的葛根素、大豆苷、大豆苷元

12、和物質A藥動參數(shù)結果顯示：全方中各成分的AUC都比單味葛根大，Cmax都比單味葛根高，說明葛根配伍黃芩、黃連和甘草能提高葛根主要成分的入血量和血清中濃度，突出了葛根在葛根芩連湯中君藥的地位。四種成分在葛根芩連湯和單味葛根的t1/2和Tmax有快有慢，也有一致的，CL值有高有低，說明葛根中各成分體內(nèi)吸收代謝是多樣性的。 葛根芩連湯全方中的鹽酸小檗堿、巴馬汀和藥根堿AUC比單味黃連藥材小，說明黃連配伍后可以降低這三種成分的入血量；C

13、L都比單味黃連高，說明黃連在配伍后這三種成分代謝加快。黃連單煎液中的鹽酸小檗堿、巴馬汀和藥根堿的Cmax也較全方高，該結果提示全方配伍能抑制黃連各成分吸收入血，從而使其在腸道內(nèi)發(fā)揮作用。黃連中這三種主要成分的Tmax和t1/2在單味黃連和葛根芩連湯全方中各有不同，再一次提示了中藥成分體內(nèi)過程的復雜性和多樣性。 綜上所述，大鼠的隱血實驗和病理切片結果顯示：黃連的部分毒性在通過配伍后能降低；通過比格犬中黃連主要成分藥動學研究結果進一