1、本文通過(guò)對(duì)野油菜黃單胞菌α-淀粉酶基因進(jìn)行分段克隆，對(duì)其N端和C端進(jìn)行截短然后在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，通過(guò)對(duì)表達(dá)酶學(xué)性質(zhì)的研究來(lái)探討其基因結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。 克隆到一個(gè)截去信號(hào)肽的產(chǎn)α-淀粉酶的重組質(zhì)粒(pKSAMY2)并在大腸桿菌DH5α中表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該不含信號(hào)肽的淀粉酶具有酶活。這說(shuō)明不含信號(hào)肽的酶能夠正確折疊并保持其空間結(jié)構(gòu)，具有其催化中心和底物結(jié)合部位。試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽序列對(duì)于胞內(nèi)的α-淀粉酶(KSXC2)活

2、性沒(méi)有任何影響。 為了研究C端非催化區(qū)對(duì)催化能力和特異性的影響，我們克隆了三個(gè)大小不同的截短的α-淀粉酶。重組表達(dá)載體pKSXC1、pKSXC3和pKSXC4分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，重組菌株經(jīng)0.5％可溶性淀粉誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物都具有酶活，經(jīng)10％的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)后用凝膠成像分析軟件分析其分子量分別為14kDa，25.7kDa,35.8kDa，與從截短淀粉酶核苷酸序列推算出來(lái)的氨基酸的分子量大小一

3、致。分析截短酶活性質(zhì)發(fā)現(xiàn)截短α-淀粉酶(KSXC1)的活性略高于出發(fā)α-淀粉酶的酶活，這說(shuō)明截去保守區(qū)B，C，D區(qū)的酶活性中心沒(méi)有改變，也不是表達(dá)量的變化使酶活提高。據(jù)推測(cè)可能失去保守區(qū)B，C，D的影響，酶活中心與底物結(jié)合的效率和特異性發(fā)生改變。兩個(gè)截短酶(KSXC3和KSXC4)的最適溫度與出發(fā)菌株酶(KSXC)相同。然而這三種酶的熱穩(wěn)定性卻存在著比較大的差異。 生物信息學(xué)分析表明，該α-淀粉酶的具有四個(gè)保守區(qū)域，分別為保守區(qū)