1、中國協(xié)和醫(yī)科大學;中國醫(yī)學科學院博士學位論文人鈣周期素結合蛋白（CacyBP）基因的克隆和功能研究姓名：劉衛(wèi)霞申請學位級別：博士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：袁建剛;強伯勤2002.6.1生里墊塑墨型查堂塑主塑窒蘭堡苧侶p 2 3 ( c o —c h a p e r o n ，一種類似H s p 2 0 的分子伴侶蛋白) 相似性達9 5 ％，并據(jù)此推測了C a c y B P 的三級結構。為了得到鈣周期素結合蛋白的多克隆抗體，以

2、便于在組織和細胞水平對該蛋白進行研究，將鈣周期素結合蛋白的編碼區(qū)克隆至原核表達載體p E T 2 8 c 上，用I P T G 進行誘導表達。利用目的蛋白質N 端融合的6 個組氨酸標簽，用親和層析的方法進行純化，得到純度很高的目的蛋白質。用純化的鈣周期素結合蛋白每兩周一次免疫兔子，得到了高效價( 1 ：1 6 萬) 的多克隆抗體。為了研究鈣周期素結合蛋白的組織表達譜，從小鼠腦c D N A 文庫中擴增出C a c y B P 編碼區(qū)核苷

3、酸序列，N o r t h e r n 雜交小鼠多組織膜，結果表明C a c y B P 在小鼠各個組織中都有表達。為了從蛋白水平觀察C a c y B P 的組織表達譜，用制備的兔抗人C a c y B P 抗血清檢測小鼠的8 種組織。發(fā)現(xiàn)C a c y B P 在小鼠各種組織中廣泛表達。只是在骨骼肌、肝、胃、胎盤、子宮中高表達，在腦、肺組織中中等量表達，在腎臟中沒有檢測到表達。為了分析鈣周期素與鈣周期素結合蛋白的相互作用，將純化后的

4、G S T —C a c y 融合蛋白與神經母細胞瘤細胞系S H - S Y 5 Y 細胞總蛋白提取液共純化的結果表明鈣周期素結合蛋白能與G S T —C a c y 共純化，但用酵母雙雜交系統(tǒng)驗證二者在細胞內的相互作用沒有得到陽性結果。考慮到鈣周期素在體外能與鈣周期素結合蛋白結合，而鈣周期素與細胞周期有關，對鈣周期素結合蛋白與細胞周期的關系進行了研究：采用T d R 雙阻斷的方法使人宮頸癌細胞系H e l a 細胞周期同步化于G 1