1、腹腔內(nèi)惡性腫瘤特別是來(lái)源于胃腸道和卵巢的低分化惡性腫瘤，常常由于腫瘤細(xì)胞的脫落或者通過(guò)淋巴管、血管等形成腹腔腫瘤播散，從而導(dǎo)致術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)，降低腫瘤病人術(shù)后的生存率。腹腔溫?zé)峁嘧⒒?IHCP)是臨床上治療腹腔腫瘤播散的有效措施，它可有效殺滅腹腔播散的腫瘤細(xì)胞，提高病人的生存率。但是它同放療、化療一樣，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)于增生活躍的組織或細(xì)胞，如腸上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、造血組織等也會(huì)產(chǎn)生毒副作用，因而限制了它們的抗腫瘤效應(yīng)。腹腔溫

2、熱灌注化療對(duì)于腸上皮細(xì)胞的損傷引起諸如惡心、嘔吐和腹瀉等不良反應(yīng)而引起研究者的重視，研究發(fā)現(xiàn)這種損傷通常是p53依賴誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡所致。因此如何降低腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡成為減輕其抗腫瘤治療副效應(yīng)的重要措施。有研究報(bào)道p53特異性抑制劑PFT-α(PFT-α)通過(guò)抑制p53而使小鼠能夠耐受致死劑量的放療，并且不會(huì)誘發(fā)新的腫瘤形成。PFT-α通過(guò)抑制p53依賴誘導(dǎo)的凋亡，成為治療抗腫瘤副效應(yīng)的手段而受到研究者的關(guān)注。P

3、FT-α是否能夠?qū)峄熣T導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用以及保護(hù)機(jī)制如何則成為值得研究的課題之一，從而為通過(guò)抑制p53而減輕抗腫瘤副效應(yīng)探索新的治療手段。 目的：一、探討p53特異性抑制劑PFT-α對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖以及對(duì)熱化療抗腫瘤作用的影響。研究PFT-α對(duì)熱化療損傷結(jié)腸上皮細(xì)胞后細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期影響以及調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制。 二、研究PFT-α對(duì)熱化療損傷結(jié)腸上皮細(xì)胞后，p53在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位和蛋白表達(dá)，以及p5

4、3靶基因Bax、MDM2、p21WAF1/CIP1蛋白和mRNA表達(dá)變化，探討PFT-α對(duì)熱化療損傷結(jié)腸上皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。 三、研究PFT-α對(duì)腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)大腸癌細(xì)胞系DLD1(突變型p53)腹腔播散BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)觀察小腸上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2、MDM2和p21WAF1/CIP1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的變化，以及細(xì)胞色素C(cytochromeC，CytC)在小腸上皮細(xì)胞線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的蛋

5、白表達(dá)，探討PFT-α對(duì)腹腔溫?zé)峁嘧⒒煋p傷BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制。 方法：原代培養(yǎng)采用手術(shù)切除的結(jié)腸粘膜，運(yùn)用Ⅰ型膠原酶和噬熱菌蛋白酶進(jìn)行體外人結(jié)腸上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)。采用MTT法分析不同濃度的PFT-α對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞以及熱化療抗腫瘤作用的影響；熱化療以及PFT-α聯(lián)合熱化療作用結(jié)腸上皮細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布；AnnexinV-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。蛋白印跡法(Weste

6、rnblot)和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscriptasepolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞CyclinB1的蛋白和mRNA表達(dá)，Westernblot檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞的Cdc2(Tyr15)蛋白表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)和Westernblot觀察熱化療以及PFT-α聯(lián)合熱化療對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞p53在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的定位、蛋白表達(dá)變化。Westernblot檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞Bax、MDM

7、2和p21WAF1/CIP1在不同處理因素下蛋白含量的變化。RT-PCR檢測(cè)結(jié)腸上皮細(xì)胞Bax、MDM2和p21WAF1/CIP1mRNA表達(dá)水平的變化。運(yùn)用大腸癌細(xì)胞系DLD1(突變型p53)腹腔播散BALB/c鼠模型，TUNEL法觀察了PFT-α對(duì)腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡的影響，Westernblot檢測(cè)BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2、MDM2、p21WAF1/CIP1以及細(xì)胞色素C在小腸上皮

8、細(xì)胞線粒體和細(xì)胞質(zhì)中的蛋白表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞Bax、Bcl-2、MDM2、p21WAF1/CIP1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：一、PFT-α的濃度低于50μM時(shí)，對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響，而當(dāng)其濃度達(dá)到60μM時(shí)，PFT-α可抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)濃度達(dá)到70μM時(shí)，PFT-α對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)更加明顯(P＜0.01)。當(dāng)PFT-α濃度在5μM～40μM之間時(shí)，PFT-α對(duì)DLD1細(xì)

9、胞的生長(zhǎng)并不產(chǎn)生任何影響，當(dāng)濃度達(dá)50μM時(shí)，PFT-α對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的抑制效應(yīng)(P＜0.05)，濃度達(dá)60μM，則這種抑制效應(yīng)更趨明顯(P＜0.01)，PFT-α自身表現(xiàn)出細(xì)胞毒效應(yīng)。當(dāng)PFT-α聯(lián)合熱化療處理DLD1細(xì)胞時(shí)，PFT-α的濃度低于40μM，對(duì)于熱化療殺傷DLD1細(xì)胞無(wú)增強(qiáng)或減弱效應(yīng)，而當(dāng)濃度達(dá)到50μM和60μM，PFT-α可以增強(qiáng)熱化療對(duì)于DLD1細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，表現(xiàn)出細(xì)胞毒副作用的疊加效應(yīng)。 二、

10、在熱化療損傷后，結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡率升高，凋亡率顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)。PFT-α聯(lián)合熱化療處理結(jié)腸上皮細(xì)胞后，細(xì)胞的凋亡率逐漸下降，細(xì)胞停滯于G2/M期，與熱化療組比較凋亡率顯著下降，G2/M期顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，呈濃度依賴性。同時(shí)CyclinB1蛋白、mRNA表達(dá)水平以及Cdc2(Tyr15)蛋白表達(dá)隨PFT-α濃度增大而逐漸升高。PFT-α抑制熱化療誘導(dǎo)的結(jié)腸上皮細(xì)胞p53核轉(zhuǎn)位，降低熱化療誘導(dǎo)的p53在細(xì)胞核中

11、的蛋白表達(dá)水平，隨PFT-α濃度增大，結(jié)腸上皮細(xì)胞Bax、MDM2、和p21WAF1/CIP1蛋白和mRNA表達(dá)逐漸降低。 三、隨PFT-α劑量增加，PFT-α對(duì)腹腔溫?zé)峁嘧⒒熣T導(dǎo)的BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞凋亡的抑制作用逐漸增強(qiáng)，凋亡指數(shù)顯著低于腹腔溫?zé)峁嘧⒒熃M(P＜0.01)。Bax、MDM2、p21WAF1/CIP1蛋白和mRNA表達(dá)水平逐漸降低，而B(niǎo)cl-2蛋白和mRNA表達(dá)則上升。PFT-α抑制腹腔溫?zé)峁嘧⒒煂?dǎo)致

12、的BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞線粒體細(xì)胞色素C蛋白向細(xì)胞質(zhì)的釋放，使細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平隨PFT-α劑量的升高而降低。 結(jié)論：一、PFT-α在低于50μM時(shí)對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖無(wú)任何影響，高于60μM則對(duì)該細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)。PFT-α在低于40μM時(shí)對(duì)于熱化療抗腫瘤作用無(wú)影響，高于50μM時(shí)則與熱化療具有協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)熱化療的抗腫瘤作用。 二、PFT-α對(duì)于熱化療導(dǎo)致的結(jié)腸上皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，通過(guò)抑制熱

13、化療誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡，保護(hù)效應(yīng)呈濃度依賴性增強(qiáng)。PFT-α通過(guò)增強(qiáng)CyclinB1蛋白和mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)Cdc2(Tyr15)磷酸化水平升高，降低CyclinB1/Cdc2的活性，使細(xì)胞停滯于G2/M期。PFT-α抑制p53的核轉(zhuǎn)位，使p53主要位于細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平抑制p53靶基因Bax、MDM2和p21WAF1/CIP1的表達(dá)，從而降低熱化療導(dǎo)致的結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護(hù)結(jié)腸上皮細(xì)胞的作用。 三、

14、PFT-α作用于腹腔溫?zé)峁嘧⒒煋p傷DLD1腹腔播散BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞后，其小腸上皮細(xì)胞的凋亡顯著降低。Bax、MDM2、p21WAF1/CIP1的蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白和mRNA表達(dá)增強(qiáng)。同時(shí)降低細(xì)胞色素C從BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞線粒體向細(xì)胞質(zhì)中的釋放。因此PFT-α可使BALB/c鼠小腸上皮細(xì)胞免受腹腔溫?zé)峁嘧⒒煋p傷，其保護(hù)效應(yīng)機(jī)制是PFT-α不僅通過(guò)調(diào)控凋亡基因和促凋亡基因的表達(dá)，而且調(diào)控細(xì)胞色素