1、目的：構(gòu)建針對NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表達(dá)載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制p65基因表達(dá)，為研究NF-κB信號通路提供技術(shù)工具；并利用構(gòu)建的RNAi腺病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制．p65表達(dá)，觀察NF-κB信號通路對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法：設(shè)計合成三對針對p65 mRNA不同位點(diǎn)的shRNA編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過體外同源重組構(gòu)建重組。RNAi腺病毒表達(dá)載體；在HEK293A細(xì)胞中包裝并擴(kuò)增病毒

2、、空斑實驗法進(jìn)行病毒滴度測定，獲得高滴度的病毒上清；腺病毒感染血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304株，Western Blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測構(gòu)建的RNAi腺病毒對p65表達(dá)的抑制效果，并探討不同的感染復(fù)數(shù)(MOI值)及病毒感染后不同時間對p65抑制效應(yīng)的影響；利用RNAi腺病毒抑制1965表達(dá)，探討NF-κB信號通路對ECV304細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 結(jié)果：1．成功構(gòu)建了針對p65基因三個不同位點(diǎn)的RNAi腺病毒表達(dá)載體，經(jīng)PCR和

3、測序鑒定干擾片段的堿基序列及插入位點(diǎn)完全正確；2．在HEK293A細(xì)胞中包裝、擴(kuò)增腺病毒，獲得高滴度腺病毒上清；測定擴(kuò)增第二代的病毒液滴度在3.0×10<'9>pfu～2.5×10<'10>pfu之間，可滿足后續(xù)實驗需要；3．構(gòu)建的三個RNAi腺病毒感染ECV304細(xì)胞后均可使p65表達(dá)量明顯下降，RNAi腺病毒MOI值15～25即可以實現(xiàn)對ECV304細(xì)胞p65表達(dá)的有效抑制；4.RNAi腺病毒感染ECV304細(xì)胞后48h開始檢測到p

4、65表達(dá)量下降，且隨時間延長p65表達(dá)量進(jìn)一步減少，抑制效應(yīng)可持續(xù)六天以上；5．腺病毒感染ECV304細(xì)胞3d、5d、7d后MTT檢測，RNAi腺病毒組與空病毒組相比，細(xì)胞增殖率明顯下降(p<0.05或p<0.01)：但流式細(xì)胞檢測結(jié)果提示對ECV304細(xì)胞凋亡的影響不明顯。 結(jié)論：構(gòu)建NF-κB p65特異的RNAi腺病毒表達(dá)載體能有效抑制p65基因的表達(dá)，可以作為研究NF-κB信號通路的重要技術(shù)手段；NF-κB信號通路對正常