1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophiclateralsclerosis，ALS）是一種病因未明神經(jīng)系統(tǒng)變性病，選擇性損傷大腦皮層運動神經(jīng)元、腦干運動神經(jīng)核神經(jīng)元、脊髓前角a運動神經(jīng)元，導致進行性加重的肌肉無力、萎縮，最終因呼吸肌麻痹死亡。有許多流行病學的危險因素，例如暴露于重金屬、電或機械損傷、劇烈的體育活動都會影響到肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)的發(fā)病。但是還有兩個廣為接受的危險因素:年齡和性別。研究表明男性發(fā)病率高于女性，49歲以前

2、男女發(fā)病率之比為3.98∶1，55歲以后男女發(fā)病率之比為1.63∶1;且男性發(fā)病早于女性[1];家族性ALS動物模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病時間雄性早于雌性，生存時間雌性大于雄性[2]，說明性別可能是其ALS發(fā)病的危險因素，性激素可能對ALS發(fā)病過程中神經(jīng)元的變性、丟失發(fā)揮作用。
　　另有研究發(fā)現(xiàn)ALS患者男性以肢體發(fā)病為主，女性以球部發(fā)病為主[1]?？夏岬喜∈且环NX-連鎖的雄激素受體基因突變引起的運動神經(jīng)元病，主要影響高

3、位頸髓及延髓的下運動神經(jīng)元，以上肢發(fā)病常見[3]。家族性肌萎縮側(cè)索硬化動物模型(SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠)的特征性臨床表現(xiàn)為成年（12周左右）發(fā)病，后肢運動功能障礙并逐漸進展至終末期(17-20周)[4]。目前有關(guān)雄激素受體(AR)在ALS小鼠脊髓表達情況的報道少見。
　　本實驗應(yīng)用免疫熒光的方法，觀察家族型肌萎縮側(cè)索硬化動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）病程腰段脊髓前角細胞雄激素受體的表達與分布情況，應(yīng)用免疫組化的方法計數(shù)

4、家族型肌萎縮側(cè)索硬化動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）病程腰段脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)目及觀察運動神經(jīng)元雄激素受體的表達情況，旨在探討ALS的發(fā)病過程中雄激素受體的作用，為ALS發(fā)病機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、模型建立及分組
　　B6SJL-BTg(SOD1G93A)1Gur/J半合子雄鼠與B6SJLF1/J+/+雌鼠1∶1雜交，在恒溫、恒濕、12h光照/黑暗交替循環(huán)、無特殊病原菌的(Specif

5、icpathogenfree，SPF)環(huán)境中，喂以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料及滅菌水，經(jīng)剪尾尖提取DNA、PCR擴增后、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示(Fig.1):位于200-300bp之間的條帶(236bp)為mSOD1的PCR產(chǎn)物，此種小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。沒有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠。
　　參考VercelliA[5]等的1-5分評分法進行評分，4分為發(fā)病時間，1分為死亡時間，

6、60天為癥狀前期，4分為癥狀早期，1分為終末期。各對照組為同窩、同月齡未轉(zhuǎn)人突變的SOD1基因的小鼠。每組雌雄各3只小鼠。
　　2、取材
　　10％水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心臟灌注4％多聚甲醛固定20min，取小鼠腰段脊髓，以4％多聚甲醛固定48h。
　　3、免疫熒光
　　后固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用免疫熒光三標染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察雄激素受體在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段

7、脊髓前角中的細胞定位。
　　4、免疫組化染色
　　后固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用ABC方法進行SMI-32及AR免疫組化染色，計數(shù)脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量及觀察運動神經(jīng)元AR受體表達。脊髓前角α運動神經(jīng)元數(shù)量的計數(shù)方法:對連續(xù)切片的每第五張切片的雙側(cè)脊髓前角的α運動神經(jīng)元計數(shù)，每段腰髓觀察10個切片。被計數(shù)的α運動神經(jīng)元標準為:位于前角、直徑＞25μm，細胞核清楚[6]。
　　5、統(tǒng)計學處理
　　采用SPS

8、S13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。采用均數(shù)±標準差表示腰膨大脊髓切片兩側(cè)神經(jīng)元計數(shù)之和，三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個獨立樣本比較的t檢驗，以a=0.05為顯著性檢驗標準。
　　結(jié)果:
　　1、模型建立
　　如Fig.1所示:位于200-300bp之間的條帶(236bp)為mSOD1的PCR產(chǎn)物，此種小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。沒有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1

9、G93A轉(zhuǎn)基因鼠。
　　2、免疫熒光
　　SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角運動神經(jīng)元有雄激素受體表達，且位于胞漿，而星型膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞均無雄激素受體表達;對照組與ALS小鼠一致(Fig.2)。
　　3、免疫組化染色(SMI-32)
　　SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.67±2.92、14.73±2.84、8.47±2.72，各組比較P值分別為0.000、0.0

10、00、0.000，差別均有統(tǒng)計學意義(Fig.3，Table1)。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.60±3.20、17.47±3.40、8.47±3.44，各組比較P值分別為0.015、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計學意義(Fig.4，Table2)。雄雌對比，P值分別為0.953、0.024、1.000，僅發(fā)病期差別有統(tǒng)計學意義(Fig.5，Table3)。
　　4、免疫組化染

11、色（AR）
　　4.1與免疫熒光結(jié)果一致，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠AR表達于脊髓前角運動神經(jīng)元，且位于胞漿，胞漿著色均勻一致，隨病情進展，未出現(xiàn)顆粒樣沉積。對照組與ALS小鼠一致（Fig.6）。
　　4.2SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.87±1.81、14.93±1.67、8.67±1.23，各組比較P值分別為0.000、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計學意義(Fig.7

12、，Table4)。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.80±1.97、17.67±2.13、8.67±1.59，各組比較P值分別為0.000、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計學意義(Fig.8，Table5)。雄雌對比，P值分別為0.924、0.001、1.000，僅發(fā)病期差別有統(tǒng)計學意義(Fig.9，Table6)。
　　5、免疫組化(SMI-32)和免疫組化（AR）的比較
　

13、　SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠各期SMI-32免疫陽性的神經(jīng)元計數(shù)與AR免疫陽性的神經(jīng)元計數(shù)相比，P值分別0.823、0.816、0.798，差異均無統(tǒng)計學意義(Fig.10，Table7)。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠P值分別為0.839、0.848、0.840，差異均無統(tǒng)計學意義(Fig.11，Table8)。
　　結(jié)論:
　　1.正常小鼠腰段脊髓前角細胞:雄激素受體(AR)在運動神經(jīng)元表達，且位于胞漿，星型膠質(zhì)細胞