1、流感病毒主要感染呼吸道上皮細(xì)胞，通過呼吸道黏膜進(jìn)入動(dòng)物和人體。因此，黏膜免疫在預(yù)防流感病毒感染的研究領(lǐng)域中顯得尤為重要。 本研究在雞胚中進(jìn)行流感病毒的培養(yǎng)，收獲病毒后進(jìn)行滅活、濃縮及純化得到流感全病毒滅活抗原，經(jīng)裂解后得到流感病毒裂解抗原。將全病毒滅活抗原分別與霍亂毒素B亞單位(Cholera toxin B，CTB)、蛋白體(Proteosomes)、氫氧化鋁(AI(OH)<,3>)三種佐劑配伍，將裂解病毒分別與上述三種佐劑配

2、伍，進(jìn)一步探討其滴鼻免疫小鼠和豚鼠后誘導(dǎo)的免疫效果，最后通過比較篩選出最有效的流感黏膜疫苗。 1.本試驗(yàn)從流感病毒的培養(yǎng)，濃縮，純化等方面優(yōu)化了制備流感全病毒滅活抗原的條件。試驗(yàn)采用雞胚培養(yǎng)流感病毒，A型病毒在33℃孵箱中培養(yǎng)56 h，B型病毒在33℃孵箱中培養(yǎng)72 h，收獲病毒后，用終濃度為0.02％的甲醛4℃滅活12 h，采用截流分子量為10 ku的超濾膜包進(jìn)行流感病毒的濃縮，濃縮倍數(shù)大約控制在25～30倍之間，之后采用非連

3、續(xù)蔗糖密度梯度液(從離心管底向上依次為60％，45％，30％的蔗糖溶液)，4℃，30000 r/min，離心2 h，純化濃縮的病毒液，透析去糖，PEG濃縮后得到最終的單價(jià)滅活病毒液。流感病毒裂解抗原制備方法基本同流感全病毒滅活抗原。我們所采用的裂解劑是終濃度為5％的Triton X-100，20℃，裂解12 h。經(jīng)過滅活驗(yàn)證試驗(yàn)，單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、電鏡分析等一系列鑒定，用該套方法制備的流感全病毒滅活抗原可用于后續(xù)試驗(yàn)。 2.在流

4、感全病毒抗原組中，單獨(dú)以流感全病毒抗原滴鼻免疫小鼠，其sIgA以及HAI水平均高于各佐劑組，說明，單獨(dú)以流感全病毒抗原滴鼻免疫小鼠，不但刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，且誘導(dǎo)了機(jī)體的黏膜免疫應(yīng)答；而在流感裂解病毒抗原組中，以蛋白體為佐劑的流感裂解抗原滴鼻免疫小鼠，引起的特異性血清IgG、IgA、IgM及HAI明顯高于流感裂解抗原單獨(dú)滴鼻組及其余佐劑組，說明以蛋白體作為佐劑可顯著提高抗原的免疫原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，而且誘導(dǎo)呼吸道

5、黏膜產(chǎn)生sIgA，加強(qiáng)了機(jī)體的局部黏膜免疫應(yīng)答，這對于流感病毒的抗感染免疫具有關(guān)鍵作用。 3.用不同劑量的蛋白體-三價(jià)流感裂解抗原和三價(jià)流感裂解抗原滴鼻免疫小鼠，結(jié)果顯示：佐劑組中，當(dāng)免疫劑量達(dá)到4μg/只時(shí)，可顯著提高小鼠血清IgG，IgM以及HAI水平，小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞CD4<'+>/CD8<'+>值顯著高于其余各試驗(yàn)組，說明，該劑量組機(jī)體體液免疫反應(yīng)強(qiáng)于其余各劑量組，且不引起免疫抑制；佐劑組中，當(dāng)免疫劑量達(dá)到4μh/只時(shí)

6、，呼吸道黏膜抗體sIgA水平明顯升高，說明，該劑量組黏膜免疫反應(yīng)明顯高于其余各劑量組；無佐劑組，各劑量組各項(xiàng)檢測指標(biāo)均處于較低水平，說明，單獨(dú)以三價(jià)流感裂解抗原滴鼻免疫小鼠，僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生微弱的免疫反應(yīng)；在相同劑量條件下，佐劑組各項(xiàng)檢測指標(biāo)均顯著高于無佐劑組，說明，蛋白體作為流感裂解抗原的佐劑滴鼻免疫小鼠，可明顯提高機(jī)體的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和黏膜免疫反應(yīng)。 4.以不同劑量三價(jià)流感全病毒抗原滴鼻免疫小鼠，在一定抗原劑量范圍內(nèi)，血清IgG、HA

7、I以及sIgA呈現(xiàn)抗原劑量依賴性，即隨抗原劑量的加大，各項(xiàng)檢測指標(biāo)水平升高，當(dāng)免疫劑量達(dá)到8μg/只時(shí)，血清IgG、HAI以及slgA達(dá)到峰值，抗原劑量再次加大時(shí)，各檢測指標(biāo)出現(xiàn)下降，說明8μg/只劑量組可明顯提高機(jī)體系統(tǒng)免疫應(yīng)答和呼吸道黏膜免疫應(yīng)答。而小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞CD4<'+>/CD8<'+>值隨抗原劑量的加大而降低，當(dāng)免疫劑量達(dá)到8μg/只時(shí)，CD4<'+>/CD8<'+>值達(dá)到最低值，再次提高抗原劑量時(shí)，該值回升，說明，8μ