1、目的:隨著生活習慣及飲食結構的變化,近年來脂肪性肝病的發(fā)病率越來越高,成為危害公共衛(wèi)生的重要因素。而飽和游離脂肪酸可以誘導肝細胞脂肪變性,通過“兩次打擊”導致脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)非編碼微小RNA miR-34a在脂肪性肝病中高表達,因此,本實驗擬應用飽和游離脂肪酸及參與脂肪性肝病調(diào)控的miR-34a建立肝細胞損傷模型,研究它們對肝細胞生物學活性的影響,為進一步探索脂肪性肝病的發(fā)病機制,以及尋找有效防治脂肪性肝病措施提供

2、前期基礎。
　　方法:(1)瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒到HepG2細胞中,24h后在熒光顯微鏡下觀察GFP綠色熒光的表達;36h后收細胞通過RT-PCR檢測miR-34a的表達。(2)不同濃度的棕櫚酸處理正常、瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒的HepG2細胞,MTT法檢測棕櫚酸和miR-34a對HepG2細胞增殖的影響。(3)實驗分為空白對照、棕櫚酸處理、miR-3

3、4a轉(zhuǎn)染、miR-34a轉(zhuǎn)染+棕櫚酸處理四個組,用DAPI分別給四個組的細胞染色,顯微鏡下觀察細胞核的形態(tài)學變化;并用細胞衰老特異性β-半乳糖苷酶試劑盒檢測細胞衰老情況。(4)收集四個處理組的細胞,用RT-PCR檢測細胞衰老相關基因P21,P53,細胞周期相關基因CDK6,CyclinE2,E2F1以及細胞炎性因子TNF-α,MCP的表達。(5) western blot檢測四個處理組細胞周期蛋白CDK6和細胞衰老相關蛋白Sirt1的表

4、達。
　　結果:(1)由于載體pEGFP-C1帶有GFP基因,因此表達質(zhì)粒在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光。瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1/miR-34a質(zhì)粒到HepG2細胞中,24h后在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光的表達;RT-PCR結果顯示,36h后miR-34a在其轉(zhuǎn)染的HepG2細胞中高表達,而在空載組中表達為陰性。(2)不同濃度的棕櫚酸處理HepG2細胞,MTT法檢測棕櫚酸可抑制HepG2細胞增殖,并且呈劑量

5、依賴關系;而棕櫚酸和miR-34a聯(lián)合處理細胞可明顯抑制HepG2細胞增殖。(3)研究表明,衰老細胞的細胞核體積增大,細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶在酸性條件下被催化生成深藍色的沉積產(chǎn)物。本實驗結果顯示棕櫚酸和miR-34a聯(lián)合處理細胞DAPI染色發(fā)現(xiàn)細胞核體積增大,應用試劑盒檢測也發(fā)現(xiàn),實驗組細胞特異性β-半乳糖苷酶呈深藍色。(4) RT-PCR結果顯示,與對照細胞相比較,miR-34a和棕櫚酸聯(lián)合作用于HepG2細胞,使與細胞衰老相關的基因p