1、細胞間粘附分子1（intracellular adhesion molecule-1 ICAM-1）是一種細胞表面單鏈糖蛋白，參與抗原識別、補體結合、細胞粘附功能。可溶性細胞間粘附分子1（soluble intracellular adhesion molecule-1 sICAM-1）為細胞表面ICAM-1脫落所形成，其表達是導致Graves’病發(fā)生的重要因素之一，并且其血清水平對于判斷Graves’病的停藥和復發(fā)具有重要意義。ICA

2、M-1的免疫功能主要集中在膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)，本實驗室張志友等已完成了對該功能區(qū)基因的克隆及融合蛋白的表達，并用所得到的融合蛋白初步免疫家兔制備了多抗。國外雖然有商品ICAM-1膜外區(qū)全長的抗原，但是性能不穩(wěn)定，不能滿足標記純度的要求，且價格昂貴，因此如能進一步得到ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白純品，用來做抗原標準，即可建立檢測人血清sICAM-1含量的超微量分析技術，進而建立更經(jīng)濟實用的檢測方法，符合我國國情，將會有一定的經(jīng)濟意義和明

3、顯的臨床應用前景。 目的： 1.原核表達GST-ICAM-1膜外Ⅰ-Ⅲ功能區(qū)融合蛋白，純化后用凝血酶酶切融合蛋白去除GST標簽，應用免疫親和層析和高壓液相方法探索蛋白分離純化的最優(yōu)條件，以獲取ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 2，構建重組質粒ZPET28aICAM-1，原核表達只帶His標簽的融合蛋白HisTag-ICAM-1，以獲取ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 方法： 1.利用本室構建并

4、保存的重組ZpET42aICAM質粒轉化宿主菌E.ColiBL21（DE3），IPTG誘導表達，表達產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化，得到GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白。應用凝血酶對融合蛋白進行酶切，SDS-PAGE電泳鑒定酶切結果。用飽和硫酸銨法從本室制備的含兔抗人ICAM-1的兔血清中粗提IgG，再用Protein A Sepharose CL-4B凝膠進行IgG的進一步提純，得到兔抗人ICAM-1的IgG純品

5、，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定后，用于CNBr-activited Sepharose CL-4B凝膠免疫親和層析，得到ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白；此外還探索應用高壓液相方法對酶切后蛋白進行分離純化。 2.構建重組質粒ZPET28aICAM-1，質粒轉化宿主菌E.Coli BL21（DE3），IPTG誘導表達，表達產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化，得到His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。SDS-PAGE電泳鑒定

6、蛋白純化結果并計算分子量，Western Blot檢測His-ICAM-1的免疫活性，考馬斯亮藍染色法定量，即可初步得到具有免疫學活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 結果： 1.GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白的免疫親和層析分離、純化 重組質粒ZpET42aICAM轉化宿主菌后在最佳條件下表達，表達產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化。凝血酶在4℃酶切60小時，可以將GST-ICAM-1膜外

7、Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白完全酶切開，SDS-PAGE電泳顯示酶切后得到兩條條帶，即：ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白，分子量為38.2kD和GST蛋白，分子量為28.0kD。開始免疫親和層析后從3ml兔抗血清中用飽和硫酸銨法和Protein A凝膠親和層析法提純兔抗人ICAM-1 IgG純品，獲得約6mg，再用于CNBr-activited Sepharose CL-4B凝膠進行的免疫親和層析，初步得到具有免疫學活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ

8、功能區(qū)蛋白。 2.GST-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白的高壓液相法分離、純化 凝血酶酶切后經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示兩條明顯的條帶，即GST和ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白，經(jīng)改變條件反復探索確定應用HPIC法流動相為3％乙腈，0.02％TFA，0.02M乙酸銨，PH值為6.0，在此條件下進樣收集樣品濃縮處理后，作SDS-PAGE和Western blot鑒定，發(fā)現(xiàn)雖有免疫學活性但是GST和ICAM-1膜外Ⅰ～

9、Ⅲ功能區(qū)蛋白未完全分開，依然顯示兩條條帶。 3.His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)融合蛋白的表達、純化及鑒定 構建重組質粒ZPET28aICAM-1，質粒轉化宿主菌E.Coli BL21（DE3），以IPTG為誘導劑，濃度1mM，20℃誘導6小時。表達產(chǎn)物用His.Tag融合蛋白純化系統(tǒng)純化。純化后His-ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白，產(chǎn)率為4.0 mg/L培養(yǎng)基。 結論： 1.成功地用抗體免疫親和

10、層析方法分離ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白和GST，得到具有免疫學活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。 2.應用HPLC方法分離ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白和GST，可以得到具有免疫學活性的蛋白，但是分離效果不甚理想，SDS-PAGE鑒定，依然顯示兩條條帶。 3.成功地構建了重組質粒ZPET28aICAM-1，Ni-NTA親和層析純化后可得到具有免疫學活性的ICAM-1膜外Ⅰ～Ⅲ功能區(qū)蛋白。因只帶His標簽，可