1、目的:(1)對(duì)正常外周血樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)進(jìn)行分離及純化,獲得較高純度和活性的DCs。(2)重組人IL-12腺病毒(Adv-IL12)轉(zhuǎn)染腫瘤抗原致敏的樹(shù)突狀細(xì)胞,檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞分子表型的變化、IL-12的分泌水平及誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷作用。
　　 方法:(1)采用Ficoll密度梯度離心法從正常人外周血中分離出單核細(xì)胞,聯(lián)合應(yīng)用GM-CSF、IL-4和TNF-α三種細(xì)胞因子體外培養(yǎng),促成熟為樹(shù)突狀細(xì)胞。(2)培

2、養(yǎng)HepG2細(xì)胞,制備腫瘤抗原。(3)重組人IL-12腺病毒(Adv-IL12)與HepG2細(xì)胞在6孔板中共同培養(yǎng),做劃痕實(shí)驗(yàn)。(4)腫瘤抗原致敏樹(shù)突狀細(xì)胞,再用重組人IL-12腺病毒(Adv-IL12)修飾;分組:空白DC組,DC-Adv-GFP組,DC-Adv-IL12組,(5)采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組DC的細(xì)胞表型,ELISA法檢測(cè)各組上清液中IL-12的分泌水平,MTT法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖能力以及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。

3、　　 結(jié)果:(1)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明重組人IL-12腺病毒(Adv-IL12)能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。(2)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組DC的細(xì)胞表型顯示,DC-Adv-IL12組的細(xì)胞分子表型比空白DC組明顯上調(diào),HLA-DR為(92.3±5.3)％,CD80為(93.8±4.9)％,CD83為(87.3±2.5)％,CD86為(85.7±5.3)％,CD1a為(78.1±4.7)％(P＜0.05)。(3)培養(yǎng)6小時(shí)的DC,加入腫瘤凍融抗原并經(jīng)

4、Adv-IL12修飾,在轉(zhuǎn)染后的12h、24h、48h、72h、96h,ELISA法檢測(cè)各組上清液中IL-12的分泌水平顯示,IL12的分泌逐漸增加,在96h基本達(dá)到最高水平。(4)收集各組DC,調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×105/ml接種于96孔板,作為刺激細(xì)胞,再在96孔板中加入終末濃度為1×106/ml的T細(xì)胞,作為應(yīng)答細(xì)胞,共同培養(yǎng)3天,MTT法檢測(cè)DC刺激T細(xì)胞增殖能力,空白DC組(0.53±0.08), DC-Adv-GFP組(0.

5、77±0.05),DC-Adv-IL12組(1.08±0.07),結(jié)果顯示,DC-Adv-IL12組能顯著增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖能力。(5)T細(xì)胞與各組DC以比例20∶1接種于24孔板,共同培養(yǎng)3天,收集細(xì)胞毒性T細(xì)胞作為刺激細(xì)胞,而將HepG2細(xì)胞作為應(yīng)答細(xì)胞,按效靶比10∶1、20∶1、40∶1的比率接種于96孔板,終末體積為200μm,共同培養(yǎng)24小時(shí),MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷效應(yīng),結(jié)果顯示,相同效靶比時(shí),D