1、目的:本課題主要研究宮頸癌Caski細胞中PD-L1的高表達與HPV16E7的相關性;并探討通過sPD-1阻斷PD-1/PD-L1信號途徑,以及協(xié)同HPV16E7基因對腫瘤的特異性殺傷淋巴細胞發(fā)生抑制作用的影響時,使腫瘤特異性淋巴細胞的生物學功能得以恢復的功能作用。
　　方法:(1)利用流式細胞術檢測本實驗室已建立的穩(wěn)轉細胞株PC3-E7中PD-L1的表達水平。(2)利用PCR技術克隆獲得人sPD-1的目的基因,并構建真核表達質粒

2、MSCVPIG-sPD-1。(3)將鑒定構建成功的真核表達質粒MSCVPIG-sPD-1轉染人宮頸癌Caski細胞,通過嘌呤霉素篩選出陽性克隆,并進行擴大培養(yǎng)后,利用Western blot、RT-PCR及免疫熒光技術鑒定sPD-1在Caski細胞中的穩(wěn)定表達。(4)使穩(wěn)轉MSCVPIG-sPD-1的克隆細胞與從人臍帶血分離得到的淋巴細胞混合共培養(yǎng)后,利用RT-PCR、FCM、LDH殺傷活性測定來檢測共培養(yǎng)的淋巴細胞的增殖能力及CTL和

3、NK殺傷活性。以轉染空載質粒組為陰性對照。(5)利用FCM檢測淋巴細胞與穩(wěn)轉細胞株PC3-E7混合共培養(yǎng)后,其增殖及殺傷活性的抑制作用,進一步探討sPD-1恢復HPV16E7對腫瘤特異性T細胞的抑制作用。
　　結果:(1)利用流式細胞術檢測本實驗室已建立的穩(wěn)轉細胞株PC3-E7中PD-L1明顯高表達于對照組。(2)成功克隆并構建真核表達載體MSCVPIG-sPD-1質粒,經酶切和測序鑒定完全正確。(3)將構建好的真核表達質粒MSC

4、VPIG-sPD-1轉染人宮頸癌Caski細胞,并經過嘌呤霉素的篩選陽性克隆,經過擴大培養(yǎng)后,利用western blot、RT-PCR及免疫熒光鑒定成功獲得MSCVPIG-sPD-1穩(wěn)定克隆細胞株。(4)利用RT-PCR、FCM、LDH殺傷活性測定檢測與MSCVPIG-sPD-1穩(wěn)轉細胞混合共培養(yǎng)的人淋巴細胞較陰性對照組明顯增強淋巴細胞細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10表達量明顯增多,淋巴細胞的增殖能力及殺傷活性都顯著增加。(5

5、)利用FCM檢測淋巴細胞與穩(wěn)轉細胞株PC3-3.1(-)-E7混合共培養(yǎng),淋巴細胞的增殖活性較陰性對照組顯著抑制。將轉入sPD-1基因的PC3-3.1(-)-E7克隆細胞與淋巴細胞共培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),HPV16E7對淋巴細胞生物活性的抑制作用得以逆轉。
　　結論:HPV16E7上調PD-L1表達是宮頸癌免疫逃逸機制之一,將穩(wěn)定轉染了可溶性PD-1基因的Caski細胞與人淋巴細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)淋巴細胞的增殖能力及CTL及NK殺傷活性明顯增強