1、骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchvmal stem cells，MSCs)具自我復(fù)制及多向分化潛能，能分化為骨、軟骨、脂肪、肌細胞和各種血細胞等。同時，MSCs取材方便，在體外易于分離，培養(yǎng)和擴增，因此得到了很多學(xué)者的關(guān)注。進一步研究表明<'[3]>，在不同的微環(huán)境下MSCs還可向某些附屬器官分化，如脂肪細胞、格根包爾式細胞、血管內(nèi)皮細胞和汗腺細胞等。在體外條件下還有人將成纖維細胞培養(yǎng)的上清液和EGF等加入到培養(yǎng)體系中，MSCs出現(xiàn)了表

2、皮細胞表型角蛋白的表達。這些研究都表明，MSCs在創(chuàng)傷修復(fù)尤其是皮膚損傷修復(fù)方面具有廣闊的前景和越來越重要的意義。 MSCs的分化要經(jīng)過一系列復(fù)雜的信號調(diào)控并與靶器官相互作用，信號平衡的改變可能導(dǎo)致分化結(jié)果的迥然不同，但其具體機制尚不清楚。小分子GTP酶Rho家族(RhoGTPases)是調(diào)節(jié)細胞功能的一類重要蛋白分子，參與彈性纖維形成、細胞凋亡及多條信號通路的調(diào)節(jié)；Rho/ROCK(RHO-dependent protein

3、 kinase)信號途徑是諸多調(diào)控細胞增殖的酪氨酸激酶受體信號通路的樞紐，與細胞骨架構(gòu)成、極性生長和細胞周期進程關(guān)系密切?，F(xiàn)有證據(jù)表明，調(diào)控ROCK活性對于神經(jīng)元細胞、T淋巴細胞以及角質(zhì)細胞的分化相當重要，ROCK的抑制劑還能夠加速MSCs向神經(jīng)元樣細胞的分化。2003年Raffaella等<'[4]>研究發(fā)現(xiàn)，Rho/ROCK信號途徑是決定向脂肪和肌形成過程中的關(guān)鍵分子開關(guān)，并認為對于MSCs的分化可能同樣具有意義。在誘導(dǎo)MSCs向表

4、皮細胞分化過程中，本實驗選擇Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑HA-1077(fasudil，法舒地爾)，通過對Rho/ROCK信號途徑的干預(yù)，利用體外細胞培養(yǎng)、免疫細胞化學(xué)、流式細胞儀等技術(shù)，從細胞生物學(xué)、細胞表型表達等方面來觀測其對人骨髓間充質(zhì)干細胞(humanmesenchymal stem cells，hMSCs)向表皮細胞分化的影響。 目的 探討在特定條件下法舒地爾(HA-1077)對hMSCs向表皮細胞表型

5、分化的影響。 方法 1、取胎兒股骨骨髓腔抽洗液，F(xiàn)icoll-Paque密度梯度離心法提取、培養(yǎng)并擴增hMSCs，流式細胞儀測定細胞表面CD34、CD44表達。 2、采用兒童新鮮包皮組織帖壁培養(yǎng)纖維細胞并收集上清液。 3、體外誘導(dǎo)MSCs向表皮細胞表型分化的實驗分為4組：①對照組(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM)；②誘導(dǎo)組(培養(yǎng)基，采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+10ng/mlEG

6、F)；③HA-1077誘導(dǎo)組1(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+10ng/mlEGF+10μmol/L HA-1077)；④HA-1077誘導(dǎo)組2(培養(yǎng)基采用10％FBS/DMEM+30％人成纖維細胞上清液+10ng/mlEGF+30μmol/L HA-1077)。 4、流式細胞儀檢測鑒定分組誘導(dǎo)2天后hMSCs CK5/8表達。 5、免疫細胞化學(xué)染色鑒定各組hMSCs誘導(dǎo)4天后CK5/8

7、的表達并觀察細胞形態(tài)變化，具體操作按試劑盒說明書進行。 6、在誘導(dǎo)7天后測定各組細胞CK5/8、CK10/13、CK19表達和PCNA、P．ERK的陽性率及細胞周期變化。 7、采用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，多個樣本均數(shù)比較選用單因素方差分析、兩兩比較選用最小顯著差法。p<0.05被認為有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1、采用Ficoll-Paque密度梯度離心法提取、培養(yǎng)并擴增人胚胎股骨MSCs

8、均一性良好，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示CD34陽性率約為0.12％，CD44陽性率約為91.53％。 2、分組培養(yǎng)48h后各組細胞形態(tài)無明顯變化，流式細胞儀鑒定顯示①對照組、②誘導(dǎo)組、③HA-1077誘導(dǎo)組、④HA-1077誘導(dǎo)組<,2>CK5/8陽性表達率分別為0.23±0.05％、0.95±0.09％、1.14±0.11％、2.46±0.49％，呈上升趨勢。誘導(dǎo)前后即MSCs①和②③④組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05，p<0.

9、01，p<0.01)。隨著時間延長，MSCs②③④中角蛋白陽性表達逐漸提高。 3、誘導(dǎo)后4天免疫細胞化學(xué)顯示：各誘導(dǎo)組細胞形態(tài)仍無明顯變化，免疫細胞化學(xué)染色可見MSCs①無CK5/8的表達，余各組均呈現(xiàn)不同程度的CK5/8的表達，以MSCs③④培養(yǎng)基誘導(dǎo)的表達最多。和第2天流式細胞儀測定結(jié)果一致。 4、誘導(dǎo)7天后流式細胞儀測定表明，MSCs①②③④四組中CK5/8、CK10/13、CK19的陽性表達率(見表1)均明顯呈上

10、升趨勢，在三種角蛋白的比較中：HA-1077作用前、后即MSCs②組與③或④組比較差異均顯著(p<0.01，p<0/01)，單純誘導(dǎo)前、后即MSCs①與②組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。 5、流式細胞儀顯示誘導(dǎo)7天后單純誘導(dǎo)組即MSCs②組與HA-1077作用組即MSCs③中PCNA的陽性表達率均高于(9.78±3.33％，10.72±1.05％；p<0.01，p<0.01)對照組MSCs①(3.31±0.76％)。同時

11、，細胞周期表明在MSCs①②③組中處于G0/G1期的細胞逐漸減少，處于S期的比例上升；其中單純誘導(dǎo)前、后即MSCs①與②組比較(p<0.05)，HA-1077作用前、后即MSCs②組與③組比較(p<0.01)差異顯著。 6、誘導(dǎo)7天后流式細胞術(shù)結(jié)果顯示HA-1077作用前、后即MSCs②組與③組之間的P-ERK陽性表達率比較差異顯著(p<0.01)。 結(jié)論 1、采用密度梯度離心法可得到成份均一、純度高的hMSC