1、一、研究意義和目的 單純皰疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)屬于皰疹病毒科a病毒亞科，病毒顆粒大小約180納米。根據(jù)抗原性的差別目前把該病毒分為1型和2型。人群中HSV感染較為普遍，人是皰疹病毒的自然宿主。HSV-2型主要與外生殖器感染及新生兒感染有關(guān)，可引起生殖器皰疹、新生兒皰疹。通過(guò)醫(yī)學(xué)界近年來(lái)多方面的研究表明HSV-2與宮頸癌發(fā)生有關(guān)，并且增加了AIDS的感染機(jī)會(huì)。據(jù)1992年統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有1200多

2、萬(wàn)STD新患者，生殖器皰疹病毒感染近20年增加15倍，累計(jì)人數(shù)超過(guò)2000萬(wàn)，躍升為最流行的STD之一。從STD發(fā)展趨勢(shì)看，病毒和衣原體感染引起的STD比傳統(tǒng)的性病顯得更為重要，稱(chēng)為第二代STD。如果說(shuō)以前對(duì)傳統(tǒng)的性病易于治療的話，那么對(duì)日益劇增的第二代STD病原體，尤其是病毒性STD，其危害性不僅表現(xiàn)在診斷、治療上困難增大，而且并發(fā)癥和后遺癥也更為嚴(yán)重，直接威脅人類(lèi)的生命健康。生殖器皰疹的臨床表現(xiàn)多種多樣，可表現(xiàn)為典型的水皰和糜爛，但

3、不典型和亞臨床感染者更為多見(jiàn)，后者易被人們所忽視，成為重要的感染源。目前對(duì)于單純皰疹病毒感染的檢測(cè)手段有限，血清學(xué)方法標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)體結(jié)合技術(shù)不能鑒別HSV-1和HSV-2，傳統(tǒng)的病毒培養(yǎng)法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。我們旨在建立基于HSV型特異的糖蛋白G(gG)的檢測(cè)HSV血清抗體的蛋白印跡試驗(yàn)疫吸附試驗(yàn)，為臨床中單純皰疹病毒的感染提供更快、更有效及明確的診斷方法。 大量研究表明，HSV病毒顆粒中有至少12種胞膜糖蛋白(glycoproteing)，

4、gB、gC、gD、gE/gI、gG、gH/gL、gK、gM/gN、gJ。其中g(shù)G攜帶有HSV型特異抗原決定簇，gG-2在單純皰疹2型病毒診斷、分型、疫苗研究中有舉足輕重的地位。gG-2由US4編碼，基因片段長(zhǎng)度為2100bp，可以編碼699個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。本研究分析了單純皰疹病毒Ⅰ型糖蛋白G-1和單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的B細(xì)胞抗原表位，并用信息學(xué)軟件比較了兩者之間的基因差異。研究發(fā)現(xiàn)HSV-2的gG-2基因全長(zhǎng)中包括一個(gè)與HSV

5、-1的gG-1基因高度同源的區(qū)域和一個(gè)“獨(dú)特區(qū)”。gG-1基因和gG-2基因在“獨(dú)特區(qū)”中的同源性非常低。對(duì)gG-2蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在gG-2蛋白中存在7段抗原指數(shù)以及表面可能性強(qiáng)的肽段相對(duì)集中區(qū)域。另有研究者發(fā)現(xiàn)，HSV-2的gG-2基因序列抗原區(qū)域極少突變，即使出現(xiàn)了點(diǎn)突變也不會(huì)削弱gG-2的血清學(xué)活性。該報(bào)告進(jìn)一步證實(shí)gG-2基因可以作為型特異性抗原，同時(shí)指出gG-2基因的保守性是作為HSV-2特異疫苗成分的先決條件

6、。因此，本研究將靶蛋白抗原鎖定為gG-2的“獨(dú)特區(qū)”(gG-2T)。對(duì)單純皰疹病毒gG-2T進(jìn)行擴(kuò)增、克隆。在原核系統(tǒng)中表達(dá)，并對(duì)表達(dá)蛋白的蛋白進(jìn)行純化，對(duì)其抗原活性進(jìn)行初步研究。 二、研究方法和內(nèi)容 1、從臨床確診病人水皰部位取材、分離病毒并在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)。 2、根據(jù)GenBank提供的單純皰疹病毒Ⅱ型糖蛋白G-2的基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游的引物序列是“5′-GAATTCatggcacgacccac

7、ggaagacg-3′”；下游的引物序列是5′-CTCGAGcggggttgcgggtccgg-3′。以Vero細(xì)胞病毒培養(yǎng)液上清提取的DNA為模板，擴(kuò)增gG-2基因，構(gòu)建克隆載體pGEM-T-G2，通過(guò)PCR鑒定。 3、從GenBank中下載單純皰疹病毒1型糖蛋白G-1序列，輸入LaserGene軟件包中的Editseq軟件中，截取gG-1基因片段，翻譯成氨基酸序列。利用ClustalX軟件將擴(kuò)增的gG-2基因與下載的gG-1

8、基因片段核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比較。利用Proetean和DNAMAN軟件對(duì)單純皰疹病毒1型和2型的糖蛋白G進(jìn)行抗原表位、α螺旋中心以及疏水區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，并比較它們之間的差異 4、根據(jù)序列分析結(jié)果，選定gG-2T為目的序列。根據(jù)單純皰疹病毒333株gG-2基因序列設(shè)計(jì)引物，在引物兩端加上EcoRⅠ/XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)。以pGEM-T-G2質(zhì)粒為模板擴(kuò)增gG-2T，得到pGEM-T-gG-2T重組克隆載體。 5、將p

9、GEX-4T-1載體與pGEM-T-gG-2T分別經(jīng)過(guò)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGEX-4T-1-gG-2T，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，通過(guò)雙酶切，PCR方法鑒定后測(cè)序。 6、利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳及Western-blot分析對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行初步鑒定。 7、優(yōu)化表達(dá)條件。將目的蛋白于上清表達(dá)，并使用GST親和純化試劑盒進(jìn)行表達(dá)蛋白的純化。 8、利用純化蛋白與單純皰疹病毒1型

10、、2型病人血清以及正常人血清進(jìn)行Westernblotting、間接ELISA反應(yīng)。 三、研究結(jié)果 1、Vero細(xì)胞變性，病毒成功地在Vero細(xì)胞中擴(kuò)增。 2、提取病毒DNA，擴(kuò)增單純皰疹病毒2型gG-2基因，gG-2基因全長(zhǎng)2100bp，與單純皰疹病毒2型333株gG-2基因同源性為99.5％。以gG-2基因?yàn)槟０?，擴(kuò)增并克隆gG-2T區(qū)，gG-2T區(qū)序列大小為591bp，編碼197個(gè)氨基酸。 3、利用

11、生物信息學(xué)軟件對(duì)Poly-Kyte-Doolittl親水性、Polt-Emini表面可能性、Jameson-Wolf抗原指數(shù)三參數(shù)綜合預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，HSV-2-G2蛋白C端的抗原指數(shù)較強(qiáng)。 4、通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，pGEX-4T-1-gG-2T可在大腸桿菌BL21中表達(dá)融合蛋白，分子量約為46KD。通過(guò)超聲裂解，表達(dá)的融合蛋白以上清的形式溶解在裂解液中。融合蛋白含有GST標(biāo)簽，可以通過(guò)GST親和純化柱進(jìn)行純化。 5、通過(guò)

12、調(diào)整優(yōu)化條件，獲得純度較高的重組表達(dá)蛋白gG-2T。蛋白的純化純度大于95％。 6、純化的目的蛋白能與GST多克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，能與單純皰疹病毒2型病人血清反應(yīng)，而不與單純皰疹病毒1型病人血清發(fā)應(yīng)。故通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到我們需要的目的蛋白。 四、研究結(jié)論 鑒于預(yù)防、檢測(cè)和治療HSV感染的重要性，研制新型特異性診斷試劑盒以及開(kāi)發(fā)疫苗是目前診斷和預(yù)防單純皰疹病毒感染的最可行有效的方法。前者能快速準(zhǔn)確診斷、鑒別初次感染和再次感

13、染、用于大規(guī)模HSV感染的流行病篩查，后者能使機(jī)體在抗HSV感染免疫中，發(fā)揮體液免疫和細(xì)胞免疫功能來(lái)消除HSV感染。HSV-2包膜糖蛋白gG-2基因全長(zhǎng)為2100bp，由US4基因編碼699個(gè)密碼子，包括一個(gè)與HSV-1包膜糖蛋白gG-1基因高度同源的區(qū)域和一個(gè)“獨(dú)特區(qū)”。通過(guò)對(duì)gG-1蛋白和gG-2蛋白的比對(duì)以及B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)我們發(fā)現(xiàn)，gG-1基因和gG-2基因在“獨(dú)特區(qū)”中的同源性非常低。Grabowsk等人利用噬菌體展示技術(shù)

14、發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位于gG-2“獨(dú)特區(qū)”內(nèi)的免疫顯位在氨基酸殘基的351～427、525～587內(nèi)，并通過(guò)試驗(yàn)證明這兩段氨基酸殘基只與HSV-2型單純皰疹病毒反應(yīng)而不予HSV-1型單純皰疹病毒反應(yīng)。Ikoma等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)gG-2(281aa～594aa)，檢測(cè)HSV-2型感染病人血清特異性抗體，特異性和敏感性達(dá)到95.5％。由此說(shuō)明這兩段區(qū)域的肽段適合用作臨床抗體檢測(cè)，尤其適合用作HSV-2分型診斷。 研究發(fā)現(xiàn)，HSV-2的

15、gG-2基因序列抗原區(qū)域極少突變，即使出現(xiàn)了點(diǎn)突變也不會(huì)削弱gG-2的血清學(xué)活性。該報(bào)告進(jìn)一步證實(shí)gG-2基因可以作為型特異性抗原，同時(shí)指出gG-2基因的保守性是作為HSV-2特異疫苗成分的先決條件。 本文采用分子克隆及基因重組技術(shù)成功構(gòu)建出HSV-2型gG-2T(285～482aa)基因片段，利用原核表達(dá)載體表達(dá)出含有g(shù)G-2T的融合蛋白，通過(guò)Western-Blot免疫印跡檢測(cè)表達(dá)蛋白能與GST多克隆抗體特異性結(jié)合。純化的蛋