1、動脈粥樣硬化(AS)是冠心病發(fā)病的主要原因，目前研究認為血管內皮受損在AS發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用。一氧化氮(NO)主要由NO合酶(NOS)催化L-精氨酸轉化而來，在維持血管結構和功能中起重要作用，被認為是一個關鍵的內源性抗AS分子。 近期研究發(fā)現(xiàn)，體內存在內源性NOS抑制物非對稱二甲基精氨酸(ADMA)，能減少NO合成，進而損傷內皮功能。ADMA還能誘導氧化應激和炎癥因子生成，促進內皮損傷等，可能是一個新的內源性致AS分子。二甲基

2、精氨酸一二甲胺水解酶(DDAH)是ADMA的代謝酶，其活性下降是體內ADMA累積的主要原因?？寡趸幘S生素E、普羅布考等的抗AS作用與增加DDAH活性，降低ADMA水平有關，提示DDAH/ADMA通路可能是AS防治的新靶點。 本論文在細胞和動物水平系統(tǒng)探討了ADMA致內皮功能不全的作用機制、DDAH/ADMA通路在AS形成和防治中的作用及抗氧化藥物口山酮的抗AS作用。 第一章ADMA促動脈粥樣硬化作用的研究 第一

3、節(jié)ADMA促動脈粥樣硬化形成的作用研究背景研究顯示，間隙連接通訊(CJIC)功能改變在AS發(fā)病機制中具有一定意義。GJ由細胞質膜上的蛋白質亞單位—間隙連接蛋白(Cxs)相互銜接而成。血管內皮的自穩(wěn)態(tài)及生理功能的維持，都依賴于內皮GJIC介導的信息交換和協(xié)同反應。研究表明，Cx43的表達、空間分布及結構變化以及其引起的GJIC功能變化可能在AS發(fā)病機制中具有一定意義。對內皮細胞GJIC功能和Cx43表達的影響是多種AS危險因素致內皮功能不

4、全的機制。 大量研究表明，多種因素均可通過增加細胞內氧自由基生成，氧化Cx或者改變其所在膜環(huán)境誘發(fā)Cx構象改變，導致GJIC功能障礙?；谘趸瘧な菍е翯JIC功能障礙的重要原因以及內源性ADMA能誘發(fā)氧化應激，推測ADMA可能通過致氧化作用氧化Cx43導致GJIC功能障礙，進而促進AS發(fā)生發(fā)展。 方法:實驗設4組(n=8)：①野生型C57BL/6J小鼠組；②野生型C57BL/6J小鼠外源性ADMA處理組；@ApoE基因

5、缺陷(ApoE<'-/->)小鼠組；④ApoE<'-/->小鼠外源性ADMA處理組。ADMA(5 mg/kg)每日皮下注射。4周后，眼眶取血，離心，分離血漿，檢測血漿對氧磷酶(PON1)活性、ADMA(HPLC法)濃度；開胸，迅速分離主動脈，觀察動脈粥樣損傷(蘇丹紅染色法)及主動脈內皮Cx43蛋白表達(免疫組化法)。 結論:ADMA是AS形成的重要促進物，其作用可能與下調內皮細胞Cx43表達，進而抑制間隙連接細胞間通訊功能有關。

6、 第二節(jié) NADPH氧化酶介導溶血性磷脂酰膽堿誘發(fā)的ADMA升高 背景:內皮功能紊亂與氧化應激密切相關?；钚匝?ROS)在氧化應激中起重要作用。NADPH氧化酶途徑是內皮細胞活性氧的重要來源。研究表明，內皮細胞增殖及凋亡，缺氧/復氧損傷和NO介導的內皮舒張功能障礙均涉及NADPH氧化酶活性變化。 ADMA與血管內皮功能密切相關。多種刺激因素包括氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)均可誘導ADMA生成。已知溶血性磷脂

7、酰膽堿(LPC)是ox-LDL的主要成分，能誘導ADMA生成，并能激活NADPH氧化酶誘發(fā)氧化應激。因此，本實驗探討了LPC誘導的ADMA升高是否通過NADPH氧化酶途徑誘發(fā)氧化應激，進而影響ADMA代謝酶活性而發(fā)揮作用。 方法:將人臍靜脈內皮細胞(HUVEC-12)分為：正常對照組；LPC(10mgm)損傷組；LPC+NADPH氧化酶抑制劑DPI(100和300 μM)組；LPC+黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(100μM)組。L

8、PC處理前1 h加入藥物，細胞培養(yǎng)相應時間后，收集細胞，提取蛋白，檢測PRMTI表達(Western blot)、DDAH活性(HPLC法)及細胞內ROS水平(熒光法)；收集細胞培養(yǎng)液，測定NO(Griess法)和ADMA(HPLC法)濃度；MTT法檢測細胞活性。 結論:LPC誘發(fā)ADMA水平增高與其升高NADPH氧化酶活性，進而上調PRMT表達及降低DDAH活性有關。 第三節(jié) ADMA對細胞通訊功能的影響 背景

9、:內皮細胞功能完整性的維持需要各個細胞間活動的高度協(xié)調，GJIC在其中發(fā)揮重要作用。在人臍靜脈內皮細胞主要表達Cx43。研究發(fā)現(xiàn)，AS發(fā)生發(fā)展與內皮細胞間GJIC功能缺陷密切相關，Cx43的表達、空間分布以及結構變化對AS具有重要調控作用。 LDL是促進AS斑塊發(fā)生的主要脂質成分，可誘發(fā)內皮細胞功能和結構的改變。LDL所誘發(fā)的內皮功能不全中，ADMA起重要介導作用。研究發(fā)現(xiàn)，LDL所致內皮細胞問GJIC功能改變可能是其致AS的重

10、要機制之一。本實驗在細胞水平觀察了LPC對內皮細胞GJIC功能和Cx43表達的影響。體內90％以上ADMA經組織細胞中DDAH代謝。DDAH存在DDAH1和DDAH2兩種亞型，其中DDAH2主要分布于表達內皮型NOS和誘導型NOS的血管組織，是心血管系統(tǒng)ADMA的主要代謝酶。我們利用基因轉染技術，建立了過表達DDAH2的內皮細胞，進一步探討了DDAH/ADMA通路在LPC所致GJIC功能和Cx43表達改變中的作用。 方法:

11、 (1)LPC對人臍靜脈內皮細胞GJIC功能的影響及DDAH/ADMA通路的作用在正常細胞、空載體轉染細胞及DDAH2過表達細胞，分別設立空白對照組；LPC處理組，加入LPC(10 mg/L)孵育內皮細胞24 h；LPC+NADPH氧化酶抑制劑diphenyliodioum(DPI，100μM)組；LPC+黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(100μM)組。 (2)ADMA調節(jié)GJIC及Cx43表達的機制用不同濃度ADMA處理內皮細胞

12、不同時間，觀察Cx43表達變化。 結論:DDAH/ADMA通路介導了LPC對內皮細胞GJIC及Cx43的調節(jié)作用，其機制可能涉及活性氧-p38MAPK途徑。 第二章口山酮抗動脈粥樣硬化作用及其機制研究 背景:LDL所致內皮細胞間GJIC功能改變可能是其致AS的重要機制。LDL及其氧化產物可以劑量依賴性抑制人臍靜脈內皮細胞及血管平滑肌細胞GJIC功能。近年實驗表明，AS等多種心血管疾病血管功能不全與ADMA水平升高

13、有關。LDL及ox-LDL是AS時ADMA濃度升高的主要原因，并且ADMA濃度升高也是LDL致內皮功能不全的重要介導因素。多種藥物通過降低ADMA濃度可拮抗LDL及ox-LDL的作用。 第一節(jié)口山酮對高膽固醇血癥大鼠血脂的影響 方法:實驗分預防性給藥和治療性給藥兩部分。在預防性給藥實驗，提前兩天給予大鼠三個劑量口山酮(10、30和90 mg/kg)，然后再灌以高膽固醇乳劑，連續(xù)十天；在治療性給藥實驗，給予大鼠高脂飲食一個

14、月后，再按血脂水平將高膽固醇大鼠隨機分組，給予不同劑量口山酮(10、30和90 mg/kg)，連續(xù)3周。末次給藥后禁食12 h，取血檢測血脂及丙二醛水平。 結論:口山酮可降低高膽固醇血癥大鼠血脂水平，此作用可能與其抗氧化作用有關。 第二節(jié)口山酮對Cx43表達的影響及機制 方法: 1.動物實驗實驗分4組(n=8)：①野生型C57BL/6Jdx鼠組；②ApoE<'-/->小鼠組；③低劑量口山酮組，給予ApoE

15、<'-/->小鼠口山酮(10 mg/kg)；④高劑量口山酮組，給予ApoE<'-/->小鼠口山酮(20 mg/kg)?？谏酵咳展辔附o藥。4周后，眼眶取血，分離血漿，檢測血漿PONl活性、血脂和ADMA(HPLC法)濃度；分離主動脈，觀察動脈粥樣損傷(蘇丹紅染色法)及Cx43表達(免疫組化)。 2.細胞實驗 實驗分組：空白對照組；LPC處理組：LPC(10 mg/L)孵育內皮細胞相應時間；LPC+不同劑量3，4，5，6-