1、前言：免疫抑制劑他克莫司(FK506)自從1989年被美國匹茲堡大學醫(yī)學院首次用于臨床以來，已被廣泛應用在腎、肝、心、肺、小腸等移植術(shù)后免疫排斥反應的預防和治療。作為一種新開發(fā)的，更為安全、有效的免疫抑制劑，因其作用強，不良反應較少，目前已經(jīng)成為器官移植后的首選免疫抑制劑。普遍認為，F(xiàn)K506抗排斥反應的機制是通過與細胞內(nèi)胞漿蛋白FK蛋白(FKBP)結(jié)合形成FK506-FKBP復合物，該復合物與鈣神經(jīng)堿有高度親合性，能明顯抑制磷酯酶活性

2、，抑制鈣離子內(nèi)流，從而使細胞內(nèi)鈣離子濃度下降，使鈣離子依賴的T細胞受體介導的T細胞活化和IL-2的分泌受到抑制，故以往的研究多集中在FK506對T細胞的直接作用上。 近年來，隨著器官移植的發(fā)展和對樹突狀細胞(DC)研究的深入，發(fā)現(xiàn)DC在識別自身和外來抗原、誘導宿主對移植物的免疫反應以及移植排斥和移植耐受平衡的雙向調(diào)節(jié)等移植免疫中起著重要作用。其中不成熟DC由于缺乏CD80、CD86等第二信號的表達，無法激發(fā)T細胞免疫應答，因此在

3、誘導移植免疫耐受、延長移植物存活時間方面有著十分重要的地位。故不成熟DC與移植免疫耐受的關(guān)系也成為近年的研究熱點。在此基礎上還提出了耐受性樹突狀細胞的概念，即由于缺乏B7等共刺激分子，不能活化T細胞，反而使T細胞功能失活，誘導T細胞耐受。 FK506作為移植術(shù)后防止和治療排異反應的重要免疫抑制劑之一，其強大的免疫抑制作用是否也跟它直接作用于DC，使其具有不成熟DC或是類似耐受性樹突狀細胞的性狀有關(guān)?國外曾有報道，F(xiàn)K506除抑制

4、T細胞活化外，還影響人外周血來源的DC成熟。然而，有關(guān)FK506對小鼠髓源性樹突狀細胞(BMDC)的作用的研究較少。為此，我們研究了小鼠BMDC的分化過程中，F(xiàn)K506對其表面分子MHCⅡ類分子、CD80、CD86和近年發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員B7-H1、B7-DC表達的影響，以及由此產(chǎn)生的DC功能學的變化，以期探討FK506抑制T細胞免疫反應以外的免疫抑制機制，并為后續(xù)的DC回輸在器官移植中的應用提供實驗依據(jù)。 目的：觀察他克莫司

5、(FK506)對小鼠髓源性樹突狀細胞(BMDC)的影響，探討他克莫司(FK506)抑制T細胞免疫反應以外的免疫抑制機制，并為后續(xù)的DC回輸在器官移植中的應用提供實驗依據(jù)。 方法：一、提取和培養(yǎng)髓源性樹突狀細胞：6-8周C57BL/6小鼠，取股骨和脛骨，沖洗骨髓腔，獲得骨髓細胞，將骨髓細胞放入含10％胎牛血清，GM-CSF4ng·mL-1，IL-42ng·mL-1的1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，獲得髓源性樹突狀

6、細胞。根據(jù)在細胞培養(yǎng)過程中加入不同濃度的FK506，將細胞分成4個組。A組：陰性對照，細胞未予任何處理；B組：細胞培養(yǎng)第一天加FK5060ng·mL-1，細胞培養(yǎng)結(jié)束前18小時加入DC成熟誘導劑、炎性因子LPS0.1μg·mL-1；C組：細胞培養(yǎng)第一天加FK5061ng·mL-1，細胞培養(yǎng)結(jié)束前18小時加LPS0.1μg·mL-1；D組：細胞培養(yǎng)第一天加FK50610ng·mL-1，細胞培養(yǎng)結(jié)束前18小時加LPS0.1μg·mL-1。

7、 二、FK506對DC共刺激分子表達的影響：收集培養(yǎng)完全的DC，制成細胞懸液，根據(jù)實驗要求，加入不同熒光素標記的單克隆抗體：CD11c/MHCⅡ、CD11c/CD80、CD11c/CD86、CD11c/B7-H1、CD11c/B7-DC，避光反應20min，洗滌，使用流式細胞技術(shù)進行檢測。 三、FK506對DC分泌細胞因子水平的影響：使用ELISA法檢測A、B、C、D組細胞分泌IL-12P70、TNF-α、IL-10等細胞

8、因子水平的變化。 四、混合淋巴細胞反應(MLR)檢測BMDC刺激同種T細胞增殖能力：BALB/C小鼠，無菌條件下取脾，將脾臟組織碾碎，獲取細胞懸液，將細胞轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時，獲得的未貼壁細胞即為T細胞，MLR中的反應細胞。分別收集培養(yǎng)結(jié)束的A、B、C、D組細胞，絲裂霉素C滅活，作為刺激細胞。反應細胞和刺激細胞各100μL，加入無菌96孔板的1孔，作為反應體系。使得反應細胞和刺激細胞以不同細胞比

9、(100：1，10：1，1：1)進行混合淋巴細胞反應，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5d，培養(yǎng)結(jié)束前18h，加入3H-TdR1μCi/孔，閃爍記數(shù)儀檢測待測細胞的3H-TdR摻入。 五、觀察MLR中FK506對T細胞分泌細胞因子的影響和對調(diào)節(jié)性T細胞的誘導情況：ELISA法檢測T細胞分泌IFN-γ水平，流式細胞技術(shù)檢測T細胞CD4/CD25陽性率。 六、FK506對BMDCB7-DC和B7-H1mRNA水平表達的影響：用半

10、定量RT-PCR測定其表達。Trizol常規(guī)提取BMDC總RNA，經(jīng)核酸紫外分析儀檢測，根據(jù)OD260和OD280值，計算樣品中RNA純度和含量。每個樣本取總RNA2μg，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設計引物后，以β-actin作為內(nèi)參，進行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠電泳后，用數(shù)碼凝膠圖象分析系統(tǒng)成像、條帶密度掃描，用同樣本和內(nèi)參照條帶的密度進行比較(樣本密度/內(nèi)參條帶密度)，進行半定量分析。 結(jié)果：一、FK506對DC共刺

11、激分子表達的影響：FK506明顯抑制DC共刺激分子CD80、CD86表達，促進抑制性分子B7-DC表達。與B組76.61±9.27％、72.99±4.75％比，F(xiàn)K506處理的C、D組細胞CD80、CD86表達下降至37.57±2.25％、43.22±6.60％和35.81±1.10％、37.46±0.39％，有顯著性差異(P＜0.05)。C、D組細胞B7-DC表達量為49.97±2.11％和57.71±1.71％，與B組30.73±1

12、.65％比較，差異顯著(P＜0.05)。而MHCⅡ類分子和B7-H1表達無變化。 二、FK506對DC分泌細胞因子水平的影響：FK506抑制DC分泌IL-12P70，C、D組分泌水平為250.95±87.01pg·mL-1和200.26±26.32pg·mL-1，與B組687.67±96.1pg·mL-1比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)。10ng·mL-1的FK506不但促進DC分泌IL-10，還能有效抑制DC分泌TNF-

13、α。IL-10水平由356.18±55.29pg·mL-1上升至752.20±112.76pg·mL-1，而TNF-α則從1815.7±96.1pg·mL-1下降到1309.74±275.04pg·mL-1，差異顯著(P＜0.05)。 三、FK506對DC刺激同種T細胞增殖能力的影響：FK506可以明顯的抑制DC對同種T細胞增殖能力的刺激作用。并且，在反應細胞和刺激細胞為1：1和10：1時，C組與D組對T細胞增殖能力的抑制作用與

14、FK506均呈劑量依賴關(guān)系(P＜0.05)。 四、MLR中FK506對T細胞分泌細胞因子和調(diào)節(jié)性T細胞的誘導情況：與FK506作用的C組和D組DC混合后，T細胞的IFN-γ分泌量呈劑量依賴關(guān)系的從267.46±83.49pg·mL-1下降至180.4±66.39pg·mL-1和136.29±80.55pg·mL-1(P＜0.05)。FK506并未誘導出CD4/CD25雙陽性調(diào)節(jié)性T細胞。 五、FK506對BMDCB7-D

15、C和B7-H1mRNA水平表達的影響：FK506明顯促進C組和D組B7-DC表達水平增高，樣本密度：內(nèi)參條帶密度比值顯示C組和D組B7-DC相對表達量為0.617±0.047和0.661±0.059，而B組僅為0.416±0.103(P＜0.05)。但對于B7-H1，A、B、C、D組間表達無明顯差異(P＞0.05)。 結(jié)論：免疫抑制劑FK506，尤其是作用濃度為10ng·mL-1的FK506，能在BMDC分化過程中誘導其分化成一