1、PFOS 即全氟辛烷磺酸，是一種全球性的持續(xù)性有機(jī)污染物，可以通過(guò)食物鏈富集，誘導(dǎo)多種毒性效應(yīng)；且PFOS 可以通過(guò)胎盤(pán)屏障，對(duì)子代的生存、生長(zhǎng)發(fā)育影響很大，所以對(duì)它的研究越來(lái)越多；近年來(lái)研究的熱點(diǎn)是它的肝毒性(肝腫大，肝細(xì)胞腺癌)和發(fā)育毒性(死亡率升高，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩)，因?yàn)镻FOS的這兩種毒性效應(yīng)比較顯著。
　　 但是，由于機(jī)體是由一個(gè)復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成，所以此兩種毒性的機(jī)制尚不清楚，不同的研究報(bào)道的結(jié)果也不盡相同，如PPAR

2、α是否在肝毒性進(jìn)展中的具有重要性，或肺不張是否在出生后迅速死亡效應(yīng)中的關(guān)鍵因素。
　　 而近年來(lái)，由于表觀(guān)遺傳學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)許多疾病特別是肝損傷或肝癌均與表觀(guān)遺傳改變相關(guān)，而發(fā)育毒性也與線(xiàn)粒體尤為相關(guān)。本論文以表觀(guān)遺傳毒性和線(xiàn)粒體損傷毒性為研究途徑，分別從肝臟細(xì)胞表觀(guān)遺傳效應(yīng)中的DNA 總甲基化和特異基因甲基化水平改變與否的角度出發(fā)，研究PFOS 肝毒性機(jī)制是否與其相關(guān)；另外，從心臟線(xiàn)粒體損傷及相關(guān)核酸、蛋白分子水平研究角度

3、出發(fā)，對(duì)PFOS的心臟發(fā)育毒性的可能機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 第一部分、胚胎期PFOS暴露對(duì)大鼠出生后斷乳期肝臟DNA總甲基化水平的影響
　　 目的：研究對(duì)大鼠出生前暴露于PFOS 與其出生后生長(zhǎng)發(fā)育狀況和肝臟可能發(fā)生的DNA的甲基化修飾程度的改變之間的關(guān)系。方法：用陰道沖洗涂片法檢測(cè)受孕情況；在雌性SD大鼠受孕后的2-21天，對(duì)其進(jìn)行不同劑量PFOS(對(duì)照，0.1 mg/kg/d，0.6mg/kg/d,2.0 mg/kg/

4、d）灌胃染毒；記錄母鼠孕期生長(zhǎng)速度和子鼠出生后的生存率和生長(zhǎng)速度。子鼠出生后21天，即生長(zhǎng)至斷乳期，收集血清和肝臟器官樣本。用HE染色觀(guān)測(cè)肝臟細(xì)胞正常與否；用液質(zhì)聯(lián)用法（LC/MS）檢測(cè)血清和肝臟中PFOS 含量；用總甲基化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行DNA總甲基化水平的檢測(cè)；并用BSP 產(chǎn)物純化結(jié)合質(zhì)?？寺『鬁y(cè)序法檢測(cè)LINE-1的甲基化狀態(tài)；以及用AP-PCR 方法評(píng)估CpG 島的甲基化狀態(tài)；最后用定量PCR 檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA met

5、hyltransferase，DNMT)的表達(dá)情況。結(jié)果：母鼠孕期生長(zhǎng)速度和子鼠出生后的生長(zhǎng)速度在高劑量組均顯著性減慢（p＜0.05）；總甲基化水平在最高劑量組有顯著性降低（p＜0.05）；測(cè)序顯示LINE-1的甲基化水平各組間無(wú)顯著性差異（p>0.05）；AP-PCR 方法顯示各劑量組的CpG 島甲基化水平均與對(duì)照組有顯著性差異（p＜0.05）；另外，DNMT3a 在最高劑量組的表達(dá)水平有顯著性升高。結(jié)論：出生前暴露于PFOS 降低大

6、鼠出生后的生存率和減慢其生長(zhǎng)發(fā)育速度；大鼠出生后21天肝臟總甲基化水平的降低也與出生前PFOS暴露水平相關(guān)，CpG 島甲基化水平降低也與出生前PFOS暴露水平相關(guān)。
　　 第二部分、胚胎期PFOS暴露引起出生后大鼠肝組織中個(gè)體基因甲基化狀態(tài)改變的研究
　　 目的：PFOS能夠引起一系列肝臟毒性和發(fā)育毒性，但目前機(jī)制尚不明確。本研究試圖論證DNA甲基化水平是否與PFOS 誘導(dǎo)的肝毒性早期過(guò)程相關(guān)；尤其是是否能發(fā)現(xiàn)相關(guān)的DN

7、A甲基化方面的生物標(biāo)志物，用于早期毒性的判斷。方法：在雌性SD大鼠受孕后的2-21天，對(duì)其進(jìn)行不同劑量PFOS(對(duì)照，0.1 mg/kg/d，0.6 mg/kg/d,2.0 mg/kg/d）灌胃染毒；在子鼠出生后21天，即斷乳時(shí)，收集肝臟組織樣本。用HE染色觀(guān)測(cè)肝臟細(xì)胞正常與否；用亞硫酸氫鈉測(cè)序PCR法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)，即BSP 產(chǎn)物純化結(jié)合質(zhì)?？寺『鬁y(cè)序法檢測(cè)GSTP(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶pi

8、)、p16等特定的可能為標(biāo)志性基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)；最后用定量PCR 檢測(cè)GSTP等基因的表達(dá)情況。結(jié)果：雖然顯微鏡下未見(jiàn)明顯的肝組織病理學(xué)(肝細(xì)胞腫大，空泡化等)改變，但GSTP的甲基化狀態(tài)在染毒組的斷乳期大鼠肝臟中發(fā)生了上升（高劑量組中，GSTP的啟動(dòng)子的關(guān)鍵位點(diǎn)+79,81,84的甲基化水平改變高達(dá)30％，而對(duì)照組無(wú)甲基化發(fā)生），其CpG 島甲基化狀態(tài)與出生前PFOS暴露水平呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。然而GSTP的表達(dá)卻與其甲基化水

9、平不一致，后通過(guò)檢測(cè)調(diào)控GSTP的通路Keap1-Nrf2/MafK 發(fā)現(xiàn)，雖然GSTP的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2/MafK 并沒(méi)有發(fā)生量的變化，但是Nrf2的抑制因子Keap1的表達(dá)降低了，這可能間接導(dǎo)致了GSTP的表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，GSTP的這種表達(dá)上調(diào)與機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)一致。結(jié)論：出生前暴露于PFOS使得出生后的大鼠肝臟中GSTP基因啟動(dòng)子關(guān)鍵位點(diǎn)高甲基化，這種指標(biāo)比普通病理學(xué)觀(guān)察指標(biāo)更靈敏，且反映了潛在毒性的發(fā)展趨勢(shì)；雖然大鼠機(jī)體朝著

10、毒性效應(yīng)方向發(fā)展，但是短期內(nèi)卻是表現(xiàn)的氧化應(yīng)激，這點(diǎn)正好被GSTP 啟動(dòng)子關(guān)鍵位點(diǎn)的高甲基化和GSTP的表達(dá)上調(diào)分別證實(shí)。
　　 第三部分、胚胎期PFOS暴露與出生后斷乳期大鼠心臟線(xiàn)粒體內(nèi)膜結(jié)構(gòu)功能改變的研究
　　 目的：大鼠出生前暴露于PFOS 對(duì)大鼠出生后的生長(zhǎng)發(fā)育造成很大影響，達(dá)到劑量閾值之后，子鼠的死亡率明顯升高，生長(zhǎng)發(fā)育也相對(duì)遲緩。而心臟是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵器官；線(xiàn)粒體是功能細(xì)胞器，在心肌細(xì)胞中起著重要作

11、用。本研究試圖探討心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體微觀(guān)改變與這種發(fā)育毒性之間的相關(guān)性。方法：本實(shí)驗(yàn)中使用了電鏡切片觀(guān)察線(xiàn)粒體，表達(dá)譜芯片篩選線(xiàn)粒體功能相關(guān)基因，并用定量PCR和蛋白水平檢測(cè)進(jìn)行芯片結(jié)果的驗(yàn)證，以及用光學(xué)顯微鏡對(duì)傳統(tǒng)病理學(xué)和分子毒理學(xué)方面的可能性改變進(jìn)行觀(guān)察。結(jié)果：線(xiàn)粒體電鏡照片觀(guān)察到空泡化，內(nèi)膜溶解等現(xiàn)象；表達(dá)譜芯片結(jié)果篩選選出了部分與線(xiàn)粒體功能相關(guān)的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)超過(guò)1.5倍的基因，其中包括下調(diào)的線(xiàn)粒體內(nèi)膜構(gòu)成蛋白，ATP合成酶，ATP

12、消耗酶，和上調(diào)的線(xiàn)粒體保護(hù)蛋白Ucp系列基因等；通過(guò)定量PCR和蛋白水平的驗(yàn)證得到一致結(jié)果，且有劑量-效應(yīng)關(guān)系。另外在線(xiàn)粒體損傷的后續(xù)效應(yīng)觀(guān)察中，雖然心臟切片細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察結(jié)果無(wú)顯著差異；但PCNA 增殖及TUNEL 凋亡染色觀(guān)察結(jié)果在暴露組比對(duì)照組間有一定增加。結(jié)論：大鼠出生前暴露于PFOS 對(duì)大鼠出生后心臟線(xiàn)粒體造成損傷，雖然在心臟切片形態(tài)學(xué)觀(guān)察無(wú)顯著性改變，但是線(xiàn)粒體微觀(guān)觀(guān)察結(jié)果和功能相關(guān)基因的分子水平檢測(cè)發(fā)生了顯著性改變，與損傷