1、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(tumor necrosis factor-related aDoptosis-inducing ligand，TRAIL)是1995年wiley小組首先發(fā)現(xiàn)并克隆成功的，是腫瘤壞死因子超家族中的一員，它可誘導多種轉化細胞和惡性腫瘤細胞凋亡，而對正常組織和細胞無明顯毒性作用，這種特性使TRAIL可能成為一種低毒而有前途的抗腫瘤藥。雖然天然TRAIL有良好的抗腫瘤作用，但實驗發(fā)現(xiàn)某些版本的rhTRAIL對正

2、常肝細胞等有細胞毒性，使人們對其生物安全性產(chǎn)生了懷疑。近幾年，研制抗人DR4和DR5的功能性單克隆抗體(mAb)成為TRAIL腫瘤生物治療的有效替代品。本實驗室以純化sDR5免疫BALB/c小鼠，通過細胞融合技術，獲得了誘導腫瘤細胞凋亡的抗人DR5的單克隆抗體(命名為mDRA-6)細胞株。本文對其誘導人白血病細胞凋亡活性及作用機制進行研究。 目的：觀察抗人DR5單克隆抗體mDRA-6對人白血病細胞系的凋亡誘導活性，并初步探討該抗

3、體誘導白血病細胞凋亡的分子機制。 方法：流式細胞儀檢測白血病細胞膜DR5表達水平；MTT法檢測mDRA-6對白血病細胞的生長抑制作用；通過細胞形態(tài)學變化、Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術及DNA Ladder檢測mDRA-6對白血病細胞的凋亡誘導作用。間接ELISA測定mDRA-6作用白血病細胞后激活NF-kB蛋白表達水平。Western blotting檢測mDRA-6作用后白血病細胞凋亡蛋白改變。JC-1單染

4、流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位改變。 結果：1.DR5在白血病細胞系表面的表達：在所檢測的4種白血病細胞系表面均有DR5的表達，人白血病Jurkat、U937、HL-60及Raji細胞系DR5的表達分別為97.474％、74.71％、58.8％、42.35％。 2.mDRA-6單抗對白血病細胞的細胞毒作用：MTT法檢測顯示， mDRA-6濃度為10ug/ml作用24h，對Jurkat、U937、HL-60及Raji細胞抑

5、制率分別為85.12％、52.83％、36.48％及30.46％。 3.mDRA-6單抗對白血病細胞的凋亡作用：倒置顯微鏡下所見，經(jīng)mDRA-6作用4h后，4種細胞呈現(xiàn)典型細胞凋亡的形態(tài)特征：Annexin V/PI雙染檢測mDRA-6作用于白血病細胞Jurkat、U937、HL-60、Raji的結果表明，10ug/ml的mDRA-6作用4種白血病細胞2h經(jīng)流式細胞儀檢測細胞的凋亡率分別為68.93％、41.95％、32.61％

6、、25.83％。線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)檢測mDRA-6作用于人白血病細胞Jurkat和U937的結果表明，作用4h線粒體膜電位改變率分別為52.35％和51.96％。 4.Western blotting結果：mDRA-6作用Jurkat、U937及HL-60細胞后，caspase-3、-9及Cytochrome C均有激活片段；而caspase-8僅在Jurkat細胞有激活片段，無激活的caspase-10片段；

7、在U937和HL-60細胞中僅有激活caspase-10表達，而無激活的caspase-8片段。 5.應用caspase-9、-3抑制劑均可部分抑制mDRA-6對Jurkat、U937及HL-60細胞凋亡誘導作用，應用caspase-8抑制劑mDRA-6致Jurkat細胞死亡率降低77.32％(P<0.05)，應用caspase-10抑制劑Jurkat細胞死亡率降低15.25％(P>0.05)；應用caspase-10抑制劑mD

8、RA-6致U937和HL-60細胞死亡率分別降低69.09％(p<0.05)和77.23％(p<0.05)，應用caspase-8抑制劑U937和HL-60細胞死亡率降低4.53％(P>0.05)和8.1％(P>0.05)；caspase-8/-10抑制劑對U937和HL-60細胞作用與Jurkat細胞結果相反。 6.nDRA-6作用U937、JKT、HL-60細胞15min后，NF-K B的OD值升高。 結論：1.Ju