1、目的：(1)通過(guò)建立大鼠原位肝移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，觀察從Lewis大鼠供體到BN大鼠受體肝移植后移植肝臟能否產(chǎn)生急性排斥反應(yīng)，以及輸入肝再生增強(qiáng)因子(Agumenter of liver regeneration，ALR)后，對(duì)移植肝臟免疫急性排斥反應(yīng)(Acute rejection，AR)的影響。(2)觀察移植肝臟中Th1淋巴細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)以及肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的凋亡率和活化率，以了解ALR對(duì)肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的影響

2、。(3)觀察移植肝臟中枯否細(xì)胞(Kupffer cells，KCs)細(xì)胞因子TNF-α和IL-2基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)變化，闡明ALR對(duì)KCs功能的影響。(4)通過(guò)體外分離培養(yǎng)脾臟淋巴細(xì)胞和肝臟KCs，觀察KCs在ALR抑制脾臟淋巴細(xì)胞的增殖活化、凋亡和細(xì)胞因子表達(dá)的作用，探討KCs在ALR改善大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。通過(guò)以上四部分實(shí)驗(yàn)，試圖闡明ALR在大鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)中的作用及其確切機(jī)制。 方法：(1)按“

3、二袖套法”建立近交系大鼠原位肝移植動(dòng)物模型，將大鼠分為3組：①同基因移植組(Isograft group)，②同種異基因組(Allograft group)，③同種異基因ALR干預(yù)組(ALR group)。后者于移植后用ALR 100μg/kg經(jīng)尾靜脈注入受體大鼠體內(nèi)，以后每日腹腔內(nèi)注射ALR 100μg/kg至處死受體大鼠。分別于術(shù)后3天、5天和7天活殺，收集標(biāo)本。觀察各組受鼠存活率；急性排斥反應(yīng)組織病理學(xué)分級(jí)按Banff標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，各

4、項(xiàng)評(píng)分的總和為最終急性排斥反應(yīng)評(píng)分，即急性排斥反應(yīng)指數(shù)(rejection activity index，RAI)；全自動(dòng)生化分析法測(cè)定血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和總膽紅素(TBIL)水平變化，確定近交系大鼠同種異基因肝移植后急性排斥反應(yīng)的形成及ALR對(duì)移植肝臟急性排斥反應(yīng)的影響。(2)肝移植7天后分離上述三組動(dòng)物肝臟淋巴細(xì)胞，對(duì)分離淋巴細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞活化率和凋亡率，用real time-PCR法測(cè)定淋

5、巴細(xì)胞中IFN和IL-2基因表達(dá)，用免疫組化法和Western blot蛋白印跡等方法測(cè)定淋巴細(xì)胞中IFN和IL-2蛋白質(zhì)表達(dá)；探討ALR減輕大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)的機(jī)制。(3)按上述方法建立大鼠肝移植動(dòng)物模型和進(jìn)行動(dòng)物分組，于肝移植術(shù)后7天活殺動(dòng)物取其肝臟分離KCs，提取KCs中的總蛋白和總RNA，用免疫組化法測(cè)定肝組織中TNF-α和IL-10的基因表達(dá)，用Western blot蛋白印跡法和Real time-PCR法測(cè)定KCs中

6、TNF-α和IL-10基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，探討ALR對(duì)肝移植后KCs功能的影響，闡明ALR減輕大鼠肝移植后急性排斥反應(yīng)的機(jī)制。(4)分別分離BN大鼠KCs和Lewis大鼠脾臟淋巴細(xì)胞。共分為4組：①ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細(xì)胞(A組)，②ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細(xì)胞+30μg/ml ALR(B組)，③ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細(xì)胞+KCs(C組)，④ConA 5μg/ml+脾臟淋巴細(xì)胞+KCs+30μg/ml AL

7、R(D組)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組脾臟淋巴細(xì)胞凋亡率和活化率；H3摻入法檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞增殖；ELISA檢測(cè)各組IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α細(xì)胞因子水平。 結(jié)論：(1)在未應(yīng)用任何免疫抑制劑的情況下，從Lewis大鼠供體到BN大鼠受體之間的同種異基因原位肝移植術(shù)后7天產(chǎn)生明顯的急性排斥反應(yīng)，首次證實(shí)ALR能夠明顯減輕同種異基因原位肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)，改善肝功能，降低死亡率，延長(zhǎng)生存時(shí)間。(2)首次證實(shí)ALR減輕

8、同種異基因原位肝移植后急性排斥反應(yīng)與ALR降低肝臟內(nèi)IL-2和IFN-γ表達(dá)，進(jìn)而抑制肝臟內(nèi)Th1淋巴細(xì)胞活化促進(jìn)凋亡有關(guān)。(3)首次證實(shí)ALR可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝移植后移植肝臟內(nèi)KCs細(xì)胞因子的表達(dá)抑制抑制肝臟內(nèi)Th1淋巴細(xì)胞的功能，進(jìn)而抑制急性排斥反應(yīng)。(4)首次發(fā)現(xiàn)ALR可以直接作用于淋巴細(xì)胞，抑制淋巴細(xì)胞增殖活化，但是不能直接促進(jìn)其凋亡。(5)首次證實(shí)ALR促進(jìn)淋巴細(xì)胞凋亡與ALR調(diào)節(jié)KCs中細(xì)胞因子的表達(dá)，使KCs中TNF-α基因和