1、背景和目的:
　　近年來(lái)隨著新型免疫抑制劑的問(wèn)世以及對(duì)移植免疫反應(yīng)的進(jìn)一步認(rèn)識(shí),急性排斥反應(yīng)發(fā)生率明顯下降,但移植物半壽期和移植長(zhǎng)期存活率提高并不明顯。慢性移植物功能損耗已經(jīng)成為阻礙移植器官長(zhǎng)期存活的主要原因。因此如何調(diào)控機(jī)體內(nèi)在的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以重新建立長(zhǎng)期免疫穩(wěn)態(tài)是減輕慢性移植物功能損害的關(guān)鍵,也是目前移植領(lǐng)域期待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。
　　淋巴結(jié)是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的不可或缺的組成部分,與脾臟、粘膜免疫相關(guān)組織共同構(gòu)成外周免疫器

2、官。淋巴結(jié)中富含各種免疫細(xì)胞,共同參與了對(duì)淋巴液的濾過(guò)和凈化以及產(chǎn)生包括體液免疫和細(xì)胞免疫等免疫應(yīng)答反應(yīng)。腸系膜淋巴結(jié)(MLN)是位于腸道系膜區(qū)的淋巴結(jié),是局部腸相關(guān)淋巴組織(GALT)的重要組成部分,除去上述淋巴結(jié)共同的作用之外,腸系膜淋巴結(jié)還參與了誘導(dǎo)口服免疫耐受、協(xié)助腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞下調(diào)腸道免疫應(yīng)答等作用?？诜褪苁侵附?jīng)口服途徑給予機(jī)體異體蛋白抗原,經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的自身調(diào)節(jié)進(jìn)而形成免疫系統(tǒng)對(duì)該抗原產(chǎn)生特異性免疫無(wú)應(yīng)答或者低應(yīng)答的

3、狀態(tài)。故腸系膜淋巴結(jié)在維持腸道對(duì)必須接觸的異體抗原(食物抗原、共生菌抗原)產(chǎn)生免疫無(wú)應(yīng)答或低應(yīng)答狀態(tài)起到了至關(guān)重要的作用。人體對(duì)于免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)一直是多通路多因子的復(fù)雜調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),而不是只依賴某一條信號(hào)通路或者某一種細(xì)胞分泌的單一細(xì)胞因子的作用,故腸系膜淋巴結(jié)必須作為一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能整體才能發(fā)揮出復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)功能。
　　exosome是活細(xì)胞晚期核內(nèi)體以胞吐的形式分泌到胞外形成,最早在研究紅細(xì)胞時(shí)被發(fā)現(xiàn),由于其結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)使ex

4、osome已經(jīng)成為一種新型細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)方式,且不同細(xì)胞來(lái)源的exosome因其攜帶的蛋白組成不同而具有各異的功能,如DC分泌的exosome和B細(xì)胞分泌的exosome富含共刺激分子(CD86、CD80)和MHCII分子,是T細(xì)胞活化的必需刺激因子;人類鼻咽癌來(lái)源的exosome含有l(wèi)atent membrane protein gene 1(LMP1),具有抑制T細(xì)胞活化效應(yīng);某些腫瘤細(xì)胞分泌的exosome能異常地表達(dá)Faslig

5、and(FasL),介導(dǎo)活化的細(xì)胞死亡(activated induced cell death,AICD)?，F(xiàn)已證實(shí)T細(xì)胞,B細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞,肥大細(xì)胞,上皮細(xì)胞以及多種腫瘤細(xì)胞等均能分泌exosome。那么作為結(jié)構(gòu)和功能整體的腸系膜淋巴結(jié)是否也存在組織固有exosome,并通過(guò)其進(jìn)行遠(yuǎn)端調(diào)控?為證實(shí)這一設(shè)想,我們通過(guò)提取腸系膜淋巴結(jié)組織固有exosome并檢驗(yàn)其生物學(xué)組成以及對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響。
　　材料和方法:
　　

6、本實(shí)驗(yàn)旨比較三種exosome提取方法的優(yōu)劣以找出最適用于腸系膜淋巴結(jié)源性exosome的制備方法,通過(guò)此方法完成對(duì)腸系膜淋巴結(jié)固有exosome的提取,并檢測(cè)此exosome樣本的生物學(xué)組成及其對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響:
　　(1)運(yùn)用超濾密度梯度離心法、ExoQuick Precipitation提取法、差速離心法對(duì)T細(xì)胞源性exosome進(jìn)行提取;
　　(2)通過(guò)電鏡觀測(cè),操作耗時(shí)分析,蛋白定量分析比較得出最優(yōu)提取方法;<

7、br>　　(3)通過(guò)此法對(duì)腸系膜淋巴結(jié)與外周淋巴結(jié)組織固有exosome進(jìn)行提取;
　　(4)對(duì)所得exosome通過(guò)電鏡觀測(cè),蛋白定量,SDS-PAGE電泳檢測(cè)比較,并通過(guò)HPLC-CHIP-MS/MS蛋白質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)固有exosome蛋白組成;
　　(5)最后以混合淋巴細(xì)胞培為平臺(tái)觀察其體外生物學(xué)功能,Western-Blot檢測(cè)特定細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、超濾密度梯度離心、ExoQ

8、uick Precipitation提取法、差速離心法均能夠正確的提取T細(xì)胞源性exosome;所制備的樣本呈類圓形囊泡,囊泡外周可見其膜性結(jié)構(gòu),直徑分布于30-100nm之間,可以單個(gè)分布,也可聚集成群,即為exosome。
　　2、超濾密度提取離心法能夠在經(jīng)濟(jì)省時(shí)的基礎(chǔ)上獲得無(wú)蛋白丟失的exosome樣本;ExoQuick Precipitation提取法提取耗時(shí)長(zhǎng)、提取成本高;差速離心法提取過(guò)程造成了exosome蛋白丟失;

9、
　　3、使用超濾密度梯度離心法成功的制備了腸系膜淋巴和外周淋巴結(jié)結(jié)組織源性exosome,電鏡下可見其為30-100nm均勻圓形小體,形態(tài)顯著;
　　4、蛋白定量和SDS-PAGE電泳顯示腸系膜淋巴結(jié)與外周淋巴結(jié)源性exosome所含蛋白在數(shù)量和相對(duì)分子質(zhì)量上均存在差異;
　　5、對(duì)腸系膜淋巴結(jié)源性exosome行蛋白質(zhì)譜分析,證實(shí)其蛋白含量豐富,包括:Cap1 Adenylyl cyclase-associated

10、 protein 1、Ldha L-lactate dehydrogenase A chain、Csif Cytokine synthesis inhibitory factor、Hspa8 Heat shock cognate 70 kDa protein8等蛋白;
　　6、體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)顯示對(duì)照組、MLN組、PLN組在OD450處光密度值分別為0.270±0.009、0.191±0.002、0.396±0.023,腸系膜

11、淋巴結(jié)源性exosome能抑制淋巴細(xì)胞的增殖(P<0.05),外周淋巴結(jié)源性exosome具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的作用(P<0.05);兩種淋巴結(jié)固有exosome中均有IL-10的表達(dá),且腸系膜淋巴結(jié)固有exosome中IL-10的表達(dá)強(qiáng)度要高于外周淋巴結(jié)固有exosome。
　　結(jié)論:
　　1、超濾密度梯度離心法能夠在經(jīng)濟(jì)省時(shí)的基礎(chǔ)上獲得無(wú)蛋白丟失的exosome樣本,是一種較為理想的exosome制備方法;
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