1、目的：
　　 肺癌是一種發(fā)病率、死亡率極高的惡性腫瘤。有資料顯示,2000年以來我國的肺癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢,目前我國每年的肺癌死亡人數可達60萬,居所有惡性腫瘤之首[1]。腫瘤的發(fā)病機制十分復雜,多種信號通路調控腫瘤的發(fā)生。其中,磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)信號通路尤為受到關注,它可使Akt磷酸化,進而激活或抑制其下游眾多靶蛋白,如Bad、Caspase9、N

2、F-κB、p21和p27等,從而調節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移[2]。已有文獻報道,肺腫瘤細胞中PI3K信號通路活性異常增高,而阻斷PI3K通路,則可以抑制腫瘤的生長,這部分是由于阻滯細胞周期進程引起的。
　　 S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)是在細胞周期調控中發(fā)揮重要作用的蛋白,它影響細胞的增殖與凋亡。Skp2最早是作為Cyclin-A-CDK2復合

3、物的一個組分被發(fā)王見[3],此后研究證明,Skp2也是F-box家族成員,為SCF(Skp1-Cullin-Skp2)型泛素蛋白連接酶的底物識別組分[4]。Skp2可調控細胞的G1/S期進程,其分子機制是通過介導p21,p57,E2F1,MYC,CyclinA,Cyclin E,Cyclin D1和p27等細胞周期調控因子的泛素依賴性蛋白降解而實現的[5,6]。細胞周期素依賴性蛋白激酶抑制物(Cyclin-dependent kinas

4、e inhibitor,CKI)p27是Skp2介導的主要降解底物,且只有p27的Thr-187位點磷酸化后才能被Skp2識別和泛素化降解[7]。Kei-Ichi等報道Skp2通過泛素化機制在S期與磷酸化CyclinE相連促其降解,這可能對細胞周期S期的有序發(fā)展及保持染色體核型的穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[8]。
　　 研究表明,Skp2在包括肺癌在內的多種惡性腫瘤中表達升高,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預后密切相關,有癌蛋白特性,可作為腫瘤治療的

5、新靶點[9]。正是對細胞周期調控相關蛋白的泛素化降解是Skp2促進G1向S期過渡和腫瘤發(fā)展的基礎。但肺癌中PI3K/Akt通路對Skp2表達的調控機制及其對細胞增殖的影響卻不甚明了。本實驗選取四種類型肺癌細胞系H460、LK2、H446和A549作為研究對象,探討肺癌中PI3K/Akt信號通路對Skp2蛋白的表達調控方式,及其對Skp2降解底物E2F1、p27、Cyclin E表達的影響,進而揭示PI3K/Akt信號通路對腫瘤細胞增殖、

6、細胞周期調控的可能分子機制。
　　 方法
　　 1、細胞培養(yǎng),LK2、A549細胞在含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)液、HBE、H460和H446細胞在含10％小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、在飽和濕度、在37℃、5％CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。
　　 2、細胞分組,將生長至70％匯合度的細胞分組,處理組加入PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002(濃度25 μmol/L),對照組加入等體積DMSO,作用24

7、h后收集細胞。
　　 3、應用噻唑藍(MTT)比色實驗檢測LY294002對細胞的生長和增殖情況,并繪制生長曲線,篩選LY294002的最佳作用時間。
　　 4、應用流式細胞術檢測H460、LK2、H446及A549四種細胞中對照組及處理組細胞周期變化。
　　 5、應用Western-blot法檢測H460、LK2、H446及A549四種細胞中對照組及實驗組Skp2、p27、CyclinE、E2F1蛋白的表達變化

8、。
　　 6、應用實時RT-PCR法檢測H460、LK2、H446及A549四種細胞中對照組及實驗組Skp2、p27基因的表達差異。
　　 7、應用免疫熒光法比較Skp2在肺正常細胞HBE及肺腫瘤細胞H460、LK2、H446及A549中的細胞定位差別,及LY294002處理后Skp2亞細胞定位變化。
　　 結果
　　 1、MTT法檢測細胞增殖變化
　　 加入LY294002后,H446、A549

9、、LK2、H460細胞的生長速率減慢,在24 h時四種細胞生長抑制率分別達到54.7±4.97％、55.7±3.24％、36.24％±4.56％和38.96％±3.17％。
　　 2、流式細胞術檢測細胞周期進程
　　 FCM結果顯示,H460、LK2、H446及A549四種細胞中,處理組的G1期細胞較對照組明顯增加,而S期細胞則較對照組減少,差異均有統(tǒng)計學意義,表明處理組細胞阻滯于G1/S期。
　　 3、West

10、ern-blot法檢測Skp2、p27、CyclinE、E2F1蛋白的表達
　　 與對照組相比,處理組Skp2蛋白在H460、LK2、H446及A549四種細胞中的表達水平明顯下降(P<0.01)；p27在H446、A549細胞中表達增加,在H460、LK2中表達水平幾乎不變；Cyclin E在四種細胞中表達量增加:在H460、LK2、H446細胞中,E2F1蛋白表達量下降,H446中E2F1蛋白表達量顯著高于H460、LK2中

11、,而A549中E2F1蛋白未表達。
　　 4、實時RT-PCR法檢測Skp2、p27基因的表達
　　 實時RT-PCR結果顯示,四種細胞中處理組Skp2基因表達均下降,而p27基因表達水平均升高。
　　 5、免疫熒光法檢測Skp2亞細胞定位
　　 在HBE、H460中Skp2蛋白主要定位于細胞核,LK2、H446、A549中Skp2蛋白部分表達于細胞質；抑制劑處理后LK2、H446、A549中Skp2蛋白

12、部分向細胞核轉位,H460中核膜區(qū)及細胞質中Skp2蛋白表達增加。
　　 結論
　　 1、H446、A549中存在Skp2-p27軸調控細胞周期,而在H460、LK2中下調Skp2,但未見p27增加,這兩種細胞系中p27并不是Skp2介導的降解底物。四種細胞系中E2F1、CyclinE均不為Skp2介導的降解底物。
　　 2、PI3K/Akt信號通路對Skp2轉錄水平調節(jié)是通過轉錄因子E2F1,但肺腺癌中并不通過