1、目的：
　　 腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)是1996年在NIH3T3鼠成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。TSG101蛋白介導(dǎo)了多種生物學(xué)功能,如調(diào)控囊泡運輸、細(xì)胞周期等,在多種類型的人類惡性腫瘤中存在異常表達(dá),但其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系尚未完全闡明。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extra cellular signal-regulated proteinkinase,ERK)是絲裂原活化蛋白

2、激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)家族的經(jīng)典轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,在促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化及抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)是一種低氧條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子,在多效性低氧應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究顯示TSG101在轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺中的過表達(dá)導(dǎo)致了MAPK/ERK信號通路的異常激活。另有研究表明多種因素均可以通過激活MA

3、PK/ERK信號途徑來介導(dǎo)HIF-1α的產(chǎn)生。而迄今為止,在人類乳腺癌中,這些分子的相關(guān)調(diào)控作用如何尚不清楚。因此,本研究采用靶向TSG101的siRNA方法特異性下調(diào)了乳腺癌細(xì)胞系中TSG101蛋白的表達(dá),觀察TSG101的下調(diào)對乳腺癌細(xì)胞系生物學(xué)特性的影響,同時檢測了人乳腺癌組織中三者的表達(dá)及相關(guān)性,探討了TSG101與HIF-1α、MAPK/ERK信號通路的關(guān)系。
　　 實驗材料與方法
　　 1、應(yīng)用脂質(zhì)體法將靶向

4、TSG101的siRNA轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞中。以未轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞及轉(zhuǎn)染普適型陰性對照siRNA(siRNA NC)的MCF-7細(xì)胞作為陰性對照。
　　 MTT比色法:1×103個/孔的細(xì)胞數(shù)分別接種轉(zhuǎn)染組和對照組細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),酶標(biāo)儀機(jī)檢前加入MTT培養(yǎng)細(xì)胞4小時,DMSO溶解沉淀顆粒,連續(xù)4天檢測各組細(xì)胞的吸光度值,檢測細(xì)胞增殖能力。
　　 細(xì)胞周期檢測:分別收集TSG101 siRNA

5、轉(zhuǎn)染后72小時的MCF-7細(xì)胞和對照組細(xì)胞,70％乙醇4℃固定,將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106/ml,PI染色后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期變化,Modfit LT V3.0軟件分析結(jié)果。
　　 細(xì)胞凋亡檢測:分別收集TSG101 siRNA轉(zhuǎn)染后72小時的MCF-7細(xì)胞和對照組細(xì)胞,以binding buffer重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml,加入Annexin Ⅴα-FITC和PI染液,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率變化。

6、>　　 細(xì)胞遷移能力檢測(transwell小室法):分別收集TSG101 siRNA轉(zhuǎn)染后48小時的MCF-7細(xì)胞和對照組細(xì)胞,接種到含有微孔濾膜的transwell小室,37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時后,95％乙醇固定,胎盤藍(lán)染色,顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移能力的改變情況。
　　 免疫熒光:分別取TSG101 siRNA轉(zhuǎn)染后72小時的MCF-7細(xì)胞爬片和對照組細(xì)胞爬片,4％多聚甲醛固定,Triton X-100處理,BSA封閉

7、后,分別滴加HIF-1α、p-ERK一抗,4℃孵育過夜。避光加FITC標(biāo)記二抗,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,檢測TSG101下調(diào)前后HIF-1α、p-ERK蛋白的變化。
　　 Western blot:分別提取轉(zhuǎn)染組和對照組細(xì)胞蛋白,采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和轉(zhuǎn)印,分別加入TSG101、HIF-1α、ERK1/2、p-ERK一抗和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗孵育后ECL發(fā)光。以β-

8、actin作為內(nèi)對照。檢測TSG101 siRNA后MCF-7細(xì)胞中TSG101、HIF-1α、ERK1/2和p-ERK蛋白的表達(dá)。
　　 2、本研究采用54例乳腺癌組織標(biāo)本,均來自中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院2004年-2005年行外科切除手術(shù)的乳腺癌患者,所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療。
　　 標(biāo)本經(jīng)4％甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片,經(jīng)脫蠟,脫苯,水化后,采用鏈霉菌抗生物素蛋白.過氧化物酶免疫組化法(S-P

9、)法檢測TSG101、HIF-1α和p-ERK蛋白表達(dá),以PBS代替一抗作為陰性對照,以已知陽性乳腺癌切片作為陽性對照。結(jié)果判定:以細(xì)胞漿和(或)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野,每個視野計數(shù)200個腫瘤細(xì)胞,共計1000個細(xì)胞。首先按染色強(qiáng)度評分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;再按陽性細(xì)胞所占百分比評分:陰性為0分,陽性細(xì)胞數(shù)≤10％為1分,11％～60％為2分,51％～75％為3

10、分,>75％為4分；最后按二者乘積分?jǐn)?shù)≥3定為陽性,<3為陰性。
　　 3、應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果
　　 1、使用Western blot方法,應(yīng)用抗TSG101單克隆抗體檢測,在45KD處可見特異性染色條帶。以β-actin作內(nèi)參照,對Western blot結(jié)果進(jìn)行灰度測定和分析,發(fā)現(xiàn)TSG101 siRNA組的細(xì)胞TSG101蛋白相對

11、表達(dá)量(0.1338±0.0086,0.0708±0.0091)與對照組(0.5460±0.0145,0.4782±0.6778)相比明顯降低(P<0.05)。
　　 2、TSG101 siRNA轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞增殖能力減弱,細(xì)胞凋亡率增加,細(xì)胞周期阻滯。MTT法檢測結(jié)果表明,TSG101 siRNA組的細(xì)胞增殖能力明顯低于對照組細(xì)胞(P<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),TSG101 siRNA組的細(xì)胞凋亡率增加,為13.71±1.

12、31％,與對照組相比(4.37±0.87％,6.00±0.08％),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。細(xì)胞周期檢測顯示,TSG101 siRNA組細(xì)胞G0/G1期比例(70.51±0.23％)與對照組(59.15±0.77％,59.21±0.68％)相比明顯增多(P<0.01)；S期細(xì)胞(23.65±0.78％)與對照組(34.96±0.45％,34.89±0.30％)相比明顯減少(P<0.01)。
　　 3、TSG101 si

13、RNA轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞遷移能力減弱。transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力實驗發(fā)現(xiàn),TSG101 siRNA組的細(xì)胞遷移數(shù)(4.60±0.80)與對照組(24.47±1.90,23.80±2.20)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
　　 4、TSG101 siRNA轉(zhuǎn)染后,HIF-1α和p-ERK蛋白表達(dá)減少。免疫熒光染色結(jié)果可見,TSG101 siRNA轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞HIF-1α和p-ERK蛋白染色強(qiáng)度與對照組相比明顯減弱。W

14、estern blot結(jié)果顯示,TSG101 siRNA轉(zhuǎn)染后,HIF-1α蛋白相對表達(dá)量(0.1235±0.0057)與對照組(0.6762±0.0080)相比,明顯減少(P<0.01)；TSG101siRNA轉(zhuǎn)染后,p-ERK蛋白相對表達(dá)量(0.1582±0.0093)與對照組(0.5078±0.0036)相比明顯減少(P<0.01)。
　　 5、免疫組化結(jié)果顯示,TSG101、HIF-1α和p-ERK蛋白主要定位于乳腺癌細(xì)

15、胞漿和(或)細(xì)胞核內(nèi),呈棕黃色顆粒,陽性率分別為74.07％(40/54)、77.78％(42/54)、81.48％(44/54)。統(tǒng)計學(xué)分析顯示,TSG101和HIF-1α在乳腺癌中的蛋白表達(dá)存在正相關(guān)(P<0.05)；TSG101和p-ERK在乳腺癌中的蛋白表達(dá)存在正相關(guān)(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、TSG101的下調(diào)能夠抑制乳腺癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡,阻滯乳腺癌細(xì)胞周期于G1/S期,并降低其遷

16、移能力。
　　 2、TSG101和HIF-1α在乳腺癌組織中的蛋白表達(dá)存在正相關(guān),并且TSG101的下調(diào)能夠減少乳腺癌細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá),提示TSG101在乳腺癌中可能對HIF-1α的基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性具有調(diào)節(jié)作用。
　　 3、TSG101和p-ERK在乳腺癌組織中的蛋白表達(dá)存在正相關(guān),并且TSG101的下調(diào)能夠減少乳腺癌細(xì)胞中p-ERK蛋白的表達(dá),提示TSG101在乳腺癌中可能通過MAPK/ERK信號通路發(fā)揮