1、胃癌為最常見的惡性腫瘤之一。由于早期胃癌的發(fā)現(xiàn)率低，目前收治的胃癌多數(shù)為進展期胃癌，而單純性手術治療常難以根治，化療在綜合治療中發(fā)揮了重要作用，因此成為治療胃癌的主要方法之一。但鑒于多藥耐藥(multi drug resistance，MDR)對胃癌化療的影響，相當一部分病例化療效果不理想。故研究胃癌的多藥耐藥產(chǎn)生機制對提高胃癌的化療效果、延長病人的生存期有著重要的意義。 多藥耐藥是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對

2、結構和作用機制完全不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥。其中經(jīng)典的分子機制涉及7號染色體上的mdr1基因過度表達，由它編碼的一分子量為170kd的跨膜糖蛋白(P-gp)，能起到能量依賴性藥物外排出泵功能。P-gp是由1280個氨基酸殘基構成的跨膜蛋白，通過激活ATP泵，阻礙藥物向胞內(nèi)被動擴散，并可將胞內(nèi)細胞毒藥物向膜外主動轉動，從而產(chǎn)生多藥耐藥的作用。許多研究表明，mdr1/P-gp與病人的化療效果密切相關，mdr1陽性病人生存期短、緩解率低

3、、復發(fā)率高。因此，mdr1/P-gp的檢測可作為癌癥治療結果的預測指標，也可為臨床醫(yī)生制定化療方案提供參考依據(jù)。 研究表明，P-gp的表達是通過轉錄及轉錄后水平調控及各種體內(nèi)外刺激而引起的應激反應，而轉錄因子AP-1可以介導P-gp的表達。同時，AP-1通路的調控非常復雜，文獻報道，一些信號通路可以激活AP-1的表達。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)系統(tǒng)作為調控細胞信號的主要途徑之一，可以調節(jié)細胞的生長、增殖、分化、凋亡、黏附、遷

4、移等一系列過程。研究者在一些多藥耐藥系的細胞中發(fā)現(xiàn)，MAPK通路可以影響P-gp蛋白對藥物的轉運，用特異性的抑制劑阻斷這些通路后發(fā)現(xiàn)P-gp的表達明顯減少。p38信號途徑是MAPK家族中的重要組成部分，經(jīng)外界應激刺激而激活，故又稱為MAPK應激信號通路，其在全身炎性反應、細胞凋亡、休克、腫瘤轉移、耐藥等方面具有十分重要的作用。因此，本課題以p38-MAPK途徑為切入點，重點研究其在胃癌多藥耐藥產(chǎn)生過程中的影響，并進一步揭示胃癌的MDR產(chǎn)

5、生機制，探索腫瘤細胞多藥耐藥的機理，將對腫瘤臨床化療方案的制定及耐藥的逆轉具有重要的指導意義。 本實驗主要由以下兩部分組成： 第一部分多藥耐藥基因在胃癌耐藥細胞中的表達 為明確兩種細胞系對化療藥物的耐藥性，分別采用不同化療藥物(5-氟尿嘧啶、表柔比星、順鉑)作用于胃癌細胞SGC7901與長春新堿耐藥系SGC7901/VCR細胞中，用MTT法檢測細胞活性，發(fā)現(xiàn)SGC7901/VCR細胞的生存率明顯高于SGC7901

6、，提示SGC7901/VCR可能屬于多重耐藥細胞；隨后為檢測SGC7901/VCR是否屬于特異的多重耐藥細胞株，我們分別采用Western blot和RT-PCR方法在兩種細胞株中檢測多藥耐藥基因的表達情況。結果提示無論在蛋白水平還是mRNA水平SGC7901/VCR中mdr1基因的表達明顯高于SGC7901，從而進一步提示了SGC7901/VCR的多藥耐藥特性。 第二部分胃癌耐藥細胞中多藥耐藥基因上調的分子機制研究 研

7、究報導，在人類的MDR1啟動子區(qū)域包含轉錄因子AP-1的結合位點，表明AP-1可以間接參與調節(jié)P-gp的表達；AP-1的活化又可以抵制許多藥物抗腫瘤的活性。因此我們首先采用螢光素酶報告基因系統(tǒng)來檢測和比較兩種細胞中AP-1的活性。實驗結果提示在SGC7901/VCR中AP-1活性明顯高于SGC7901；而AP-1作為MAPK通路的下游靶基因，在一些耐藥細胞中可以明顯改變MAPK的表達水平，因此我們利用Western Blot和流式細胞儀

8、檢測和比較兩種細胞中MAPK途徑的表達情況，結果我們發(fā)現(xiàn)在SGC7901/VCR細胞中p38-MAPK的活性明顯高于SGC7901；為進一步明確SGC7901/VCR細胞的這種特性，我們利用DN-p38和p38的特異抑制劑SB202190來抑制p38的表達后檢測ALP-1的活性，在SGC7901/VCR細胞發(fā)現(xiàn)與對照相比AP-1的活性表達明顯受到了抑制；從而說明p38-MAPK/AP-1途徑在SGC7901/VCR細胞中被激活了，并可能

9、與腫瘤細胞的多藥耐藥的產(chǎn)生機制密切相關。同時，用2μg/ml濃度的順鉑連續(xù)24小時作用于SGC7901后用流式細胞儀同樣檢測到了p38的活性；從而進一步提示p38-MAPK途徑與化療耐藥相關。 為進一步驗證p38-MAPK途徑是否與化療耐藥相關，我們使用p38的特異性抑制劑作用于SGC7901/VCR細胞后檢測mdr1的表達及P-gp的功能。實驗結果表明，無論在蛋白水平還是mRNA水平都可以看到在使用抑制劑后多藥耐藥基因mdr1

10、的表達都有明顯的下調：同時為檢測SB202190對P-gp功能的影響，使用流式細胞儀分析Rh123在細胞內(nèi)的積聚和貯留現(xiàn)象，結果提示在SGC7901/VCR細胞中使用抑制劑后Rh123在細胞內(nèi)的積聚和貯留有明顯的增加；本實驗提示抑制p38途徑可以降低mdr1的表達及P-gp的功能。接下來我們分別使用5-氟尿嘧啶、表柔比星、順鉑作用于被抑制了p38-MAPK途徑的SGC7901/VCR細胞中，觀察細胞形態(tài)及分析細胞的調亡的情況，結果表明抑