1、背景:MircoRNAs(miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調控功能的單鏈小分子RNA,長約20-24 nt,由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結構、長約70-80 nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶加工后生成。miRNAs通過與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3'-UTR)互補結合,在翻譯水平上特異性抑制基因表達,參與調控生物生長和發(fā)育等許多復雜的生命過程。許多miRNAs的序列在起源甚遠的物種之間相對保守,雖然這些

2、miRNAs的生物學功能目前還不十分清楚,但可以肯定的是它們有不同的表達模式,同時參與調節(jié)各種生理病理過程。異常的miRNAs表達與人類某些疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關,miRNAs被認為是一組新的癌或抑癌基因,其表達具有特異性的腫瘤組織表達譜。循環(huán)核酸(CNA)是指存在于血液(血清或血漿)等體液中的細胞外游離DNA和RNA,與生理和病理狀態(tài)下的細胞代謝密切相關,循環(huán)DNA和RNA水平的檢測及其在基因診斷等方面的應用對于惡性腫瘤等疾

3、病的診斷和監(jiān)測具有十分重要的意義。近期人們在進行循環(huán)DNA、RNA分子檢測的同時,在miRNAs方面也做了許多的工作,研究結果使得與腫瘤相關的核酸分子檢測這一領域變的更加讓人振奮。在血液中檢出腫瘤特異性的miRNAs并將其作為腫瘤的生物學標志物對于早期診斷腫瘤具有至關重要的意義。
　　 目的:
　　 1.建立起從血清中提取miRNA的方法,并檢測mir-21、mir-200c、mir-205在乳腺癌患者和健康對照人群血清

4、中的表達差異情況。
　　 2.了解mir-205對乳腺癌細胞系MCF-7生長和凋亡的影響。
　　 3.結合生物信息學技術預測miR-205的靶基因,為理解mir-205在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。
　　 4.通過本研究,希望為乳腺癌的治療提供新的分子靶點,為乳腺癌相關的診斷、預后標志物研究提供新的內容。
　　 方法：
　　 1.利用實時熒光定量RT-PCR技術,檢測并比較mir-21、mir

5、-200c、mir-205在乳腺癌病人和健康對照人群血清中的表達差異。
　　 2.利用脂質體轉染技術,上調mir-205在MCF-7細胞中的表達。利用熒光顯微鏡和熒光定量RT-PCR技術檢測該方法的有效性。利用MTT法分析轉染前后細胞增殖活性的變化；流式細胞PI法分析轉染前后細胞生長周期的變化；流式細胞儀FITC-AnnexinV/PI法分析轉染前后細胞凋亡的變化。
　　 3.應用不同的生物信息學方法對在乳腺癌細胞系MC

6、F-7中表達下調的miR-205的靶基因進行預測。
　　 結果：
　　 1.利用實時熒光定量RT-PCR法,對10例乳腺癌患者和3例健康對照人群的血清miRNA進行了檢測,成功從乳腺癌患者和健康對照人群的血清中提取出miRNA,發(fā)現(xiàn)相對于對照組,乳腺癌患者血清中mir-200c的表達上調,mir-205表達下調,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.本實驗利用脂質體轉染miRNA mimics的實驗技術,其上調miRNA

7、的有效性得到證實。發(fā)現(xiàn)上調mir-205表達水平以后會降低乳腺癌細胞MCF-7的增殖活性,增加細胞凋亡率,而對細胞周期無明顯影響。
　　 3.應用miRBase、Pictar和Targetscan三大經(jīng)典靶基因預測軟件對miR-205進行靶基因預測,在至少兩個以上軟件預測出的靶基因有113個。其多個基因涉及細胞周期、信號轉導、細胞增殖、分化和細胞凋亡等眾多生物學過程,說明miR-205在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中有著重要的生物學功能。

8、r>　　 結論：
　　 1.利用Trizol法和實時熒光RT-PCR方法能夠成功提取乳腺癌患者和健康對照人群血清中的miRNA,并且發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中mir-200c的表達上調,mir-205表達下調,有可能作為乳腺癌早期診斷的腫瘤分子標志物。
　　 2.mir-205可降低乳腺癌細胞的增殖活性,增加凋亡率,但不影響細胞周期。
　　 3.生物信息學預測miR-205可能通過調控下游一系列靶基因的轉錄和翻譯引起