1、非淀粉多糖（NSP）是廣泛存在于植物細胞壁中的抗營養(yǎng)因子，包括纖維素、半纖維素（阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖、甘露聚糖等）、果膠等物質(zhì)。豬、雞等單胃動物的胃和小腸中缺乏降解這類物質(zhì)的酶，無法充分吸收細胞內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，不僅造成了飼料的浪費，還造成了環(huán)境污染。飼料企業(yè)往往通過添加NSP酶制劑的方式來緩解或消除NSP產(chǎn)生的抗營養(yǎng)作用，而酶制劑在飼料制粒、貯藏等過程中易失活，影響了其實際利用價值。此外，在飼料中添加 NSP酶制劑還增加了飼料成本。轉(zhuǎn)

2、基因技術(shù)為上述問題的解決提供了新的思路。本研究從微生物和低等真核生物中篩選了大量 NSP酶基因，通過豬密碼子優(yōu)化及信號肽替換后克隆到pCDNA3.1(+)真核表達載體上，瞬時轉(zhuǎn)染豬PK15細胞后通過收集細胞分泌上清分析酶學(xué)性質(zhì)（最適 pH、pH穩(wěn)定性、胃/胰蛋白酶耐受性），以篩選可在豬細胞中高效表達的NSP酶基因。經(jīng)基因連接方式的篩選和優(yōu)化及體外細胞表達驗證，構(gòu)建了一條多個 NSP酶基因共表達的多順反子，并構(gòu)建了一個唾液腺特異共表達多個

3、NSP酶的載體，為新型環(huán)保轉(zhuǎn)基因豬的制備奠定基礎(chǔ)，對我國養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本研究主要結(jié)果如下：
　?。?）通過對微生物和低等真核生物來源的多個纖維素酶基因的表達活性及酶學(xué)性質(zhì)分析，篩選到兩個可在豬細胞中高效表達出具有較高活性纖維素酶的基因：egII和TeEGI，二者兼具葡聚糖酶活性。在PK15細胞中，以上兩個基因表達的纖維素酶和葡聚糖酶活性分別為0.20 U/mL（egII）、0.30 U/mL（TeEGI）（CMC

4、-Na，pH4.00）和0.61 U/mL（egII）、0.66 U/mL（TeEGI）（β-葡聚糖，pH4.62）。
　　（2）通過對微生物源的三個果膠酶基因的表達活性及酶學(xué)性質(zhì)分析，篩選到兩個可在豬細胞中高效表達出具有較高活性果膠酶的基因：PG7fn和 PG。二者在PK15細胞中表達的果膠酶最高酶活分別為1.15 U/mL（多聚半乳糖醛酸、pH4.0）和1 U/mL（多聚半乳糖醛酸、pH5.50）。
　?。?）對比分析了

5、三種微生物源木聚糖酶基因（asp-xyn、Xynl11、Penxyl）的表達活性及酶學(xué)性質(zhì)，篩選到可在豬細胞中高效表達木聚糖酶的基因：asp-xyn。以上三種木聚糖酶基因表達的最高酶活力分別為：1.88 U/mL、1.65 U/mL、0.72 U/mL（木聚糖，pH5.0）。
　　（4）通過基因重組技術(shù)，構(gòu)建了四條共表達木聚糖酶和纖維素酶的雙順反子：xyn-flag-egII-T2A，xyn-flag-egII，xyn-egII-

6、T2A，xyn-egII。其中xyn-egII融合效果最好，其木聚糖酶活性為asp-xyn表達活性的57.35％（pH5.00）；β-葡聚糖酶活性egII表達活性的46.90%（pH4.50）；CMC的活性為egII表達活性的67.97%（pH6.00）。
　　（5）成功構(gòu)建pCD-EsAPPA-T2A和pCD-TeEGI-T2A表達載體，其在PK15細胞中表達的酶活性低于單基因表達活性。
　?。?）優(yōu)化多基因共表達的連接方