1、放氧復合體(Oxygen-evolvingcomplex；OEC)是葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ的一個復合體，位于類囊體膜的腔內側，是葉綠體光反應過程中氧化水分子釋放出氧氣所不可缺少的。OEC是由三個已確定的表觀分子量為33kDa、23kDa和16kDa(編碼的基因分別為：psbO，psbP和psbQ)的多肽及一些還未確定的分子量更小的多肽組成。植物病毒學的新近研究結果表明OEC的多肽與病毒侵染后的癥狀表達有密切關系。本實驗以本生煙(Nicotian

2、a.benzhamiana)為試材，采用RT-PCR方法，克隆了編碼OEC的三個主要多肽的cDNA核苷酸序列。其中，33kDa蛋白的cDNA序列與Genbank中登錄號為AY220076(編碼普通煙N.tabacum的OEC33kDa蛋白)的同源性最高，為98.76％，推導的氨基酸序列的同源性為99.10％；23kDa蛋白的cDNA序列與Genbank中登錄號為X55354(編碼普通煙N.tabacum的OEC23kDa蛋白)的同源性最

3、高，為92.91％，cDNA的編碼序列同源性為97.07％，非同源的核苷酸主要位于3’端非翻譯區(qū)，推導的氨基酸序列的同源性為96.93％；16kDa蛋白的cDNA序列與Genbank中登錄號為AY568719(番茄中16kDa蛋白的cDNA序列)的序列同源性最高，為89.4％，推導的氨基酸序列也與AY568719編碼的序列同源性最高，為88.6％。同時也克隆了普通煙中16kDa蛋白的cDNA序列，與AY568719的同源性最高，為89.

4、7％，推導的氨基酸序列同源性為88.6％。從普通煙與本生煙葉片中測得的核苷酸序列與編碼的氨基酸序列之間的同源性分別為98.6％和99.6％(見圖2.10及2.11)。這是最先測得的煙草OEC16kDa蛋白亞基的cDNA序列。以上測得的序列已登錄到GenBank，獲得的序列號分別為AY952375，AY952374，AY887536(本生煙中33kDa，23kDa和16kDa的cDNA序列)和AY887537(普通煙中16kDa的cDNA

5、序列)。 將克隆到的OEC三種蛋白亞基的成熟肽的cDNA編碼區(qū)進行亞克隆，與原核表達載體pET22b(+)連接。獲得的重組子轉化大腸桿菌BL21(DE3)后，用IPTG進行誘導表達。SDS-PAGE和Westernblot分析表明，三種蛋白分別在大腸桿菌中得到了高效表達。采用金屬Ni2+螯合層析方法及切膠回收的方法將融合蛋白純化后免疫兔子，獲得了特異性較高的抗血清。ACP-ELISA方法測定效價分別為1/214，1/213和1/

6、214。 利用已制備的抗血清，測定了煙草花葉病毒侵染本生煙(N.benthamiana)和普通煙(N.tabacum)后上述三種蛋白的表達變化。煙草花葉病毒侵染本生煙表現(xiàn)癥狀為系統(tǒng)性葉片變小、向下卷曲，植株矮化，逐漸死亡；侵染普通煙(N.tabacum)表現(xiàn)出典型的系統(tǒng)性花葉癥狀。Westernblot分析結果表明，TMV侵染普通煙后，與對照相比，33kDa蛋白水平沒有顯著的變化，23kDa和16kDa蛋白水平顯著降低。TMV侵