1、在成年哺乳動物耳蝸中，聽覺毛細胞和神經(jīng)元在損傷后不能自然再生，這是感音神經(jīng)性聾的主要原因。近年來，成功從新生鼠耳蝸分離出耳蝸前體細胞，也有人稱之為耳蝸干細胞，在體外培養(yǎng)的耳蝸前體細胞能分化為毛細胞和螺旋神經(jīng)元樣細胞。研究耳蝸前體細胞的分化機制及微環(huán)境將為誘導(dǎo)損傷后毛細胞和螺旋神經(jīng)元再生提供依據(jù)。我們通過實驗發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)節(jié)分子cyclinA2和CRP2可能參與了耳蝸的發(fā)育以及前體細胞的增殖、分化。
　　實驗一新生大鼠耳蝸前體細胞的

2、分離、培養(yǎng)
　　目的：對新生大鼠耳蝸前體細胞進行分離、培養(yǎng)。
　　方法:從P2大鼠耳蝸分離培養(yǎng)前體細胞，血清誘導(dǎo)分化后用免疫細胞化學(xué)染色鑒定多向分化潛能，通過掃描電鏡觀察分化細胞表面的超微結(jié)構(gòu)，進一步了解分化細胞的特性。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)的細胞第3天即可見“細胞球”，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，可見細胞球體積增大。細胞球內(nèi)絕大部分細胞呈nestin和BrdU陽性，表明其具有自我更新的能力。細胞球經(jīng)誘導(dǎo)分化14d后，對分化細胞

3、行免疫熒光化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)部分細胞表達毛細胞標志物myosinVIIA，部分細胞表達星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP或者成熟神經(jīng)元標志物NeuN，證明其具有多向分化潛能。掃描電鏡下可見扁平的三角形或不規(guī)則形細胞，表面具有纖毛樣結(jié)構(gòu)，其纖毛頂端的結(jié)構(gòu)與正常耳蝸毛細胞纖毛頂端相似，此外還可見雙極神經(jīng)元形態(tài)的細胞。
　　結(jié)論:本部分實驗為研究耳蝸前體細胞的分化機制奠定基礎(chǔ)。
　　實驗二cyclinA2在大鼠耳蝸組織發(fā)育和耳蝸前體細胞分化過

4、程中的表達變化
　　目的:細胞周期分子cyclinA2具有調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換和G2/M轉(zhuǎn)換的雙重作用。目前對于cyclinA2在內(nèi)耳中的功能尚未見任何報道。我們擬通過檢測cyclinA2在大鼠耳蝸組織發(fā)育及耳蝸前體細胞分化過程中的表達情況，探討其是否參與了哺乳動物耳蝸的發(fā)育。
　　方法:一、cyclinA2在大鼠耳蝸組織發(fā)育過程中的表達情況：P2、P10和P42的SD大鼠取耳蝸組織，RT-PCR、Westernblot和免疫組

5、織化學(xué)染色的方法檢測cyclinA2的表達。二、cyclinA2在大鼠耳蝸前體細胞分化過程中的表達情況：用RT-PCR、免疫細胞化學(xué)染色和Westernblot的方法檢測cyclinA2在未分化、分化6天及分化14天耳蝸前體細胞的表達情況。
　　結(jié)果:cyclinA2表達于P2大鼠耳蝸的螺旋緣，在P10后的耳蝸未見表達。在前體細胞的分化過程中cyclinA2的表達量逐漸下降。
　　結(jié)論:在大鼠耳蝸組織發(fā)育及耳蝸前體細胞分化的

6、過程中cyclinA2表達量逐漸下降，這表明cyclinA2可能參與了大鼠出生后耳蝸的發(fā)育。
　　實驗三CRP2及CRIP2在大鼠耳蝸組織發(fā)育和耳蝸前體細胞分化過程中的表達變化
　　目的:我們實驗室在以往研究中通過RT-PCR及Westernblot首次證實LIM分子CRP2及CRIP2表達于大鼠的內(nèi)耳。其中CRP2表達于胚胎期耳蝸，在成年耳蝸中無表達；而CRIP2在不同年齡耳蝸中（包括胚胎期）表達量無明顯差異。為進一步探討

7、CRP2及CRIP2是否參與了哺乳動物耳蝸的發(fā)育，我們擬通過免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)的方法檢測CRP2及CRIP2在不同年齡大鼠耳蝸組織中的分布及耳蝸前體細胞分化前后的表達變化。
　　方法:一、CRP2及CRIP2在大鼠耳蝸組織發(fā)育過程中的表達情況：免疫組織化學(xué)染色的方法檢測其在P2、P6和P10大鼠耳蝸中的表達。二、CRP2及CRIP2在大鼠耳蝸前體細胞分化過程中的表達情況：用免疫細胞化學(xué)染色的方法檢測其在未分化和分化7天耳蝸

8、前體細胞中的表達情況。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示，CRP2主要表達于螺旋神經(jīng)節(jié)，并且在耳蝸發(fā)育過程中，其陽性細胞數(shù)逐漸減少。CRIP2主要表達于耳蝸組織中的螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋緣和Corti器，而且在P2、P6和P10各組中陽性細胞數(shù)量無明顯差異。另外，在P2組前庭的感覺上皮部位也可見CRIP2和CRP2的表達。免疫細胞化學(xué)染色顯示，CRIP2和CRP2均可表達于未分化的前體細胞，在胞核和胞質(zhì)中均呈陽性表達，CRIP2可表達于分化7

9、天細胞的胞質(zhì)。分化細胞未見CRP2的表達。
　　結(jié)論:CRP2可能參與了耳蝸的發(fā)育以及毛細胞和螺旋神經(jīng)元的增殖；CRIP2在耳蝸不同發(fā)育時期以及前體細胞分化前后均穩(wěn)定表達，表明其可能在維持耳蝸細胞基本功能中發(fā)揮一定作用。
　　實驗四耳蝸前體細胞分化的微環(huán)境對神經(jīng)干細胞分化影響的初步研究
　　目的:耳蝸前體細胞向毛細胞和螺旋神經(jīng)元定向分化的具體機制尚不清楚，前體細胞所處的微環(huán)境在分化過程中起重要作用。為探討微環(huán)境在細胞分

10、化中的作用，我們在體外將GFP標記的神經(jīng)干細胞和耳蝸前體細胞按比例混合，并誘導(dǎo)其分化，觀察耳蝸前體細胞分化的微環(huán)境對神經(jīng)干細胞分化的影響。
　　方法:將耳蝸前體細胞和GFP標記的神經(jīng)干細胞按10:1的比例混合后接種于同一培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化后進行貼壁培養(yǎng)。21天后采用免疫熒光的方法對分化細胞進行鑒定。一抗采用抗myosinVIIA（毛細胞標志物）和抗peripherin（神經(jīng)元標志物）。
　　結(jié)果:耳蝸前體細胞分化的微環(huán)境促進

11、神經(jīng)干細胞的存活，并誘導(dǎo)其向myosinVIIA陽性細胞及雙極神經(jīng)元形態(tài)細胞分化。
　　結(jié)論:耳蝸前體細胞的成功分離、培養(yǎng)為研究其分化的機制提供了一個極佳的體外模型，對于耳蝸前體細胞分化的微環(huán)境需要更加深入的研究。
　　實驗五干細胞向雛雞和成年豚鼠耳蝸移植方法的建立
　　目的:研究耳蝸前體細胞分化的機制，目的是誘導(dǎo)外源性干細胞定向分化為聽覺毛細胞及神經(jīng)元，或刺激體內(nèi)內(nèi)源性耳蝸前體細胞再生，從而修復(fù)受損的聽覺細胞。將外源

12、性干細胞或治療基因表達載體（如腺病毒等）植入耳蝸是治療的前提，為此我們建立了干細胞向動物耳蝸移植的方法。
　　方法:雛雞耳蝸的干細胞移植是經(jīng)外耳道剝離鼓膜，暴露中耳腔的蝸窗，再經(jīng)蝸窗膜造孔注入干細胞。成年豚鼠耳蝸鼓階的干細胞移植是行耳后切口暴露聽泡，在耳蝸底轉(zhuǎn)近鐙骨動脈處鉆孔，并注入GFP標記的干細胞。中階的移植是經(jīng)耳蝸第三轉(zhuǎn)的血管紋外側(cè)壁注入干細胞。細胞移植1天后，分離雛雞和豚鼠的耳蝸作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察移植細胞的分布