1、第一部分，葛根是江蘇省中醫(yī)院獨創(chuàng)中藥復方制劑“血復康”的主要成分。血復康多年來用于慢性髓細胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)的輔助治療，取得一定臨床療效。體外研究亦證實血復康可以通過降低BCR/ABL融合基因、JWA基因等表達誘導K562細胞（人慢性粒細胞白血病紅白血病變細胞株）凋亡。
　　 課題組多年來對葛根主要有效活性成分——葛根總黃酮(Puerariaeradixflavones，PRF)的深

2、入研究發(fā)現(xiàn)，PRF具有良好的抗白血病細胞效應。從細胞和分子水平證明一定濃度PRF體外干預4種急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)細胞株Kasumi-1、HL-60、NB4和U937，PRF呈濃度／時間依賴性抑制4種AML細胞株增殖，作用差異顯著，其強度依次為NB4細胞＞Kasumi-1細胞＞U937細胞＞HL-60細胞。進一步研究PRF作用最明顯的急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticl

3、eukemia，APL)細胞株NB4，發(fā)現(xiàn)較低濃度(10～50μg/ml)PRF在體外即可誘導NB4細胞凋亡，且與1μM三氧化二砷(arsenictrioxide，ATO)具有協(xié)同作用，其分子機制可能與活化JNK信號途徑，激活caspase凋亡相關家族蛋白表達，下調特征性致病融合基因PML-RARα及抗凋亡相關基因等有關。小鼠體內實驗亦證實，PRF可一定程度的改善NB4異種移植裸鼠的生活質量。同時，課題組研究也發(fā)現(xiàn)，一定濃度PRF可以誘

4、導具有特征性致病融合基因AML1-ETO的AML-M2細胞株Kasumi-1凋亡，其機制主要是通過啟動內源性凋亡途徑，與降解致病融合基因無關。在此基礎上，本課題圍繞PRF體外對不同淋巴系細胞株增殖及凋亡的影響進一步開展探索性實驗研究。
　　 [實驗目的]
　　 1、證實PRF在體外對不同淋巴系細胞株增殖的影響。
　　 2、選擇PRF增殖抑制最顯著的細胞株初步探討PRF在淋巴系細胞的可能作用及機制。
　　

5、[實驗方法]
　　 1．0～200μg/mlPRF分別處理U266細胞、RPMI8226細胞及Jurkat細胞48及72h，MTT法檢測各細胞的增殖抑制率；篩選IC50值。
　　 2．0、10、30、50、100μg/mlPRF分別處理U266細胞、RPMI8226細胞及Jurkat細胞48h，流式細胞術檢測細胞周期進程。
　　 3．0、10、30、50、100μg/mlPRF處理U266細胞48h，瑞氏染色法觀

6、察細胞形態(tài)學改變；FITC-AnnexinV/PI雙染法檢測細胞早期凋亡率改變。
　　 4．以空白細胞為陰性對照，NB4細胞為陽性對照，將U266細胞與100μg/mlPRF共培養(yǎng)48h，苯酚／氯仿法抽提DNA，2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察DNA片段。
　　 [實驗結果]
　　 1．不同濃度(0～200μg/ml)的PRF單藥處理U266、RPMI8226及Jurkat3種淋巴系細胞株48及72h，發(fā)現(xiàn)不同濃度PRF

7、可不同程度的抑制上述3種細胞增殖，強度依次為U266細胞＞RPMI8226細胞＞Jurkat細胞，呈濃度依賴性，但并無明顯時間依賴性。其中以U266細胞作用最顯著,48及72h的IC50分別為42.39及42.26μg/ml。
　　 2．流式細胞術檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)三種細胞隨藥物濃度的增加，細胞凋亡峰(sub-G1)逐漸增高，但細胞周期進程變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)。
　　 3．不同濃度(0、10、30、

8、50、100μg/ml)PRF作用于U266細胞48h，瑞氏染色觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)隨PRF濃度的增加，U266細胞數(shù)明顯減少，但實驗組較對照組細胞形態(tài)無明顯差異，未出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)；AnnexinV+/PI-檢測細胞早期凋亡率改變發(fā)現(xiàn)，各組細胞早期凋亡率呈劑量依賴性增高，分別為(5.20±0.92)%、(7.30±1.22)%、(8.10±0.53)%、(10.80±0.90)%，正常細胞對照組凋亡率為(3.20±0.36)%，組間差異具

9、有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4．DNA片段化分析發(fā)現(xiàn)，100μg/mlPRF干預48h后的NB4細胞出現(xiàn)DNA片段，細胞染色質DNA裂解成180～200bp大小不等的片段，相同藥物濃度干預48h的U266細胞則表現(xiàn)為彌散的電泳條帶，未出現(xiàn)凋亡細胞特有的DNA梯帶。
　　 [結論]
　　 1．一定濃度PRF對三種淋巴系來源細胞株具有選擇性抑制作用，尤其對兩種多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，M

10、M)細胞株抑制作用較明顯，對T細胞性急性淋巴細胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)細胞株Jurkat則不明顯。
　　 2．一定濃度PRF可部分誘導U266細胞凋亡，但并不是其增殖抑制的主要機制。結合課題組前期研究結果，我們認為PRF對不同的髓系及淋巴系細胞株均具有選擇性抑制作用，兩者作用機制可能不同。PRF抑制髓系細胞增殖主要是通過誘導凋亡實現(xiàn)的，但本研究所及三種淋巴系細胞株雖可能涉及凋亡相關