1、背景及目的：目前心血管疾病已成為嚴重威脅人類健康的主要疾病之一,尤其以心肌缺血性疾病(ischemic heart disease,IHD)最為常見,而心肌梗死(myocardialinfarction,MI)作為其中最為嚴重的一種類型是人們關(guān)注的焦點。目前,藥物、介入以及外科手術(shù)等心肌梗死的常用治療方法雖可使心臟閉塞的血管再通,改善心肌缺血和充血性心力衰竭(congestive heartfailure,CHF)的癥狀,但卻不能從根本

2、上恢復心肌細胞數(shù)量,改善心臟舒縮功能。心臟移植雖可從根本上解決心室重構(gòu)問題,但因受到技術(shù)、供體來源、費用以及社會、倫理道德等多種限制,目前尚無法廣泛應(yīng)用。隨著組織工程學及干細胞研究的深入,干細胞的分離、純化以及體外定向分化的技術(shù)得到了很大程度地提高。通過誘導干細胞定向分化為心肌細胞,并進行細胞移植來代替壞死心肌細胞,理論上可能達到改善心功能的目的,為心梗的治療提供了一種新的研究方向。但并非任何干細胞都能擔當這一角色,胚胎干細胞(embr

3、yonic stem cells,ESs)和骨骼肌干細胞就被排除,前者由于來源及倫理問題應(yīng)用受限,而后者因為分化成熟后無法與宿主細胞建立電機械偶聯(lián)。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓基質(zhì)細胞的前體,主要存在于網(wǎng)狀間質(zhì)內(nèi),而且在體外特定的誘導條件下,可以分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞等,還具有取材方便、連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能的優(yōu)點,并已有

4、眾多研究證實其可用于自體移植。故而,誘導MSCs分化為心肌細胞并將之通過細胞移植用于心肌梗死的治療目前已經(jīng)成為研究的熱點之一。目前,誘導MSCs向心肌細胞分化的研究主要集中于化學誘導分化,5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)被證實是最有效化學制劑,但其誘導MSCs分化為心肌細胞的轉(zhuǎn)化率也始終低于20％~30％,且具有細胞毒性作用,臨床應(yīng)用受到極大地限制,這就使尋找更為合適的誘導劑成為研究的熱點。有研究認為,某些細胞因子如

5、肝細胞生長因子(hepatocyte growth facto,HGF)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)等在骨髓間充質(zhì)細胞定向分化中起著重要的作用,并有足夠的理論和實驗表明使用細胞因子作為誘導分化劑在體外誘導干細胞分化為心肌細胞可能具有重要的研究與應(yīng)用價值,而且相比5-氮胞苷等眾多已有研究的化學物質(zhì),細胞因子沒有細胞毒性作用,是較為理想的干細胞誘導劑。HGF是

6、由間質(zhì)細胞分泌的一種多功能的細胞因子,它具有調(diào)節(jié)細胞生長和運動,促進多種細胞組織形態(tài)的發(fā)生等作用;它還是一種心肌營養(yǎng)因子,具有很強的促血管內(nèi)皮細胞有絲分裂,修復內(nèi)皮損傷,抑制細胞凋亡與組織重構(gòu)的作用。近年來MSCs向心肌細胞方向轉(zhuǎn)化的誘導研究多局限于細胞培養(yǎng)、動物實驗,而人骨髓間充質(zhì)干細胞(human Bone Marrow messenchymal Syem Cells,hMSCs)的體外分離、純化、定向誘導的研究報道尚少,關(guān)于HGF

7、誘導hMSCs向心肌細胞分化的研究報道就更為鮮有。結(jié)合上述研究現(xiàn)狀,本研究選擇人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)作為研究對象,采用密度梯度離心法及貼壁篩選法分離純化hMSCs,并在體外用不同濃度的HGF誘導分離純化后的hMSCs,旨在探討HGF是否能成功誘導hMSCs向心肌細胞分化以及HGF的濃度對MSCs的誘導作用是否有影響。
　　材料與方法:1.標本:骨髓來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院心臟外科2007年~2008年非青紫型先天性心臟病

8、患者,所有患者術(shù)前均排除血液系統(tǒng)疾病,并征得醫(yī)學倫理委員會批準及患者知情同意。2.處理:胸骨穿刺抽取骨髓3~5ml骨髓,肝素(100U/ml)抗凝后即送實驗室,按比例加入percoll分離液(密度1.073g/mL)行密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞,再利用貼壁篩選法純化hMSCs后,進行原代傳代培養(yǎng)。3.分組:取第3代傳代細胞,分為6組:①~⑤組為實驗組,分別加入3μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L和40μg/L HGF

9、,連續(xù)培養(yǎng)4w,每3d換液1次;⑥組為陰性對照組,不加入HGF,其余條件與實驗組相同。4.結(jié)果判定:所有分組均在顯微鏡下連續(xù)觀察誘導細胞的形態(tài)變化,并詳細記錄;再于第四周行免疫細胞化學染色鑒定心肌特異性肌鈣蛋白I(cTnI)及心肌特征性蛋白縫隙連接蛋白43(Cx43)的表達,胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞,用cTnI陽性細胞所占比例計算轉(zhuǎn)化率。5.統(tǒng)計學方法:運用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件,多個樣本均數(shù)的比較采用Kruskal-Wall

10、is H檢驗(H檢驗),組間比較采用Student-Newman-Keuls檢驗,取α=0.05為檢驗水準。
　　結(jié)果：1.顯微鏡下連續(xù)觀察結(jié)果:經(jīng)HGF誘導的各實驗組hMSCs均出現(xiàn)不同程度的增殖,誘導7d后hMSCs的形態(tài)即發(fā)生明顯改變,細胞緊密生長,體積明顯增大,紡錘形細胞比例下降,多為卵圓形或柱狀細胞,相鄰細胞間有接觸。2周后細胞之間連接愈加緊密。3~4周后,細胞增殖速度減慢,相鄰細胞間逐漸相連呈肌管狀,細胞核/胞漿比例明

11、顯降低,胞漿內(nèi)有細小的顆粒樣結(jié)構(gòu),且顆粒樣結(jié)構(gòu)多聚集于細胞核周圍。陰性對照組hMSCs無任何明顯改變。2.實驗4周后,用免疫組化法鑒定cTnI、Cx43:在陰性對照組上述兩蛋白均呈陰性表達,而在經(jīng)HGF作用后的5個實驗組中均有一定的陽性表達。其中,cTnI陽性細胞百分率(％):3μg/L組為(14.24±0.46％)、5μg/L組為(25.32±1.41％)、10μg/L組為(38.46±1.41％)、20μg/L組為(27.38±1.

12、32％)、40μg/L組為(20.36±2.15％),統(tǒng)計學分析各組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且以10μg/L組最高。
　　結(jié)論：1.hMSCs經(jīng)HGF誘導后的細胞間有肌管樣結(jié)構(gòu)形成,且存在cTnI、Cx43的陽性表達,出現(xiàn)可鑒定為心肌細胞的特異性免疫組化表現(xiàn),提示HGF在體外能夠誘導hMSCs向心肌細胞轉(zhuǎn)化。2.不同濃度HGF誘導的hMSCs轉(zhuǎn)化心肌細胞百分率不同,而10μg/L HGF誘導組相對轉(zhuǎn)化率最高,提示H