1、心肌肥大是心臟對多種病理刺激產(chǎn)生的一種適應性反應，心肌肥大最終走向心衰，引起病人死亡。其病理變化表現(xiàn)為胚胎基因如心鈉肽、腦鈉肽和β-肌球蛋白重鏈等表達增加、蛋白合成增加、心肌細胞體積增大、肌原纖維重構等。
　　 腫瘤壞死因子是一具有多種效應的炎癥性細胞因子，晚期心衰患者血清中TNF-α水平升高，在各種心肌功能損傷(如心衰有關的炎性與肥大等)的情況下都會過量表達，由心肌細胞和存在于心臟的巨噬細胞分泌，參與許多心肌病變的發(fā)生過程。T

2、NF-α是一種重要的促心肌細胞肥大因子，它引起心肌細胞肥大的機制目前尚不清楚。
　　 針對TNF-α的抗心衰治療措施是心衰治療領域的一個研究熱點。大分子蛋白類TNF-α抑制劑具有特異性好、結合能力強的特點，但也存在著穩(wěn)定性較差，在患者體內(nèi)易降解并極易產(chǎn)生免疫耐受、不良反應明顯等特點。因此，探索新的免疫抑制劑研究策略來研制靶向抗TNF-α的小分子藥物或針對受體特定區(qū)域的小分子多肽，已成為當前TNF-α抑制劑研發(fā)的熱點。針對此靶點的

3、化學小分子類藥物盡管理論上講應當是最理想的藥物，但目前以靶蛋白及其受體的復合晶體結構為模板進行計算機輔助藥物設計及虛擬篩選并沒有研發(fā)出理想的抗TNF-α的抑制劑。短肽抑制劑，由于分子量較小、作用區(qū)域明確，被認為是一類較為理想的新型TNF-α受體拮抗劑。以這些肽為前導物，依據(jù)它們的功能基團的組成及功能基團的空間構象，合成與它們具有相同構象的非肽小分子模擬物，可以在新型抗心衰藥物的開發(fā)中起導向作用。
　　 在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中，

4、細胞內(nèi)鈣信號傳遞途徑是誘導心肌肥大的最重要信號轉導通路之一。胞內(nèi)Ca2+增加是致心肌肥大的最基本信號，胞內(nèi)Ca2+增加激活鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶，激活下游信號通路，活化多種心肌肥大的相關基因，從而引起心肌肥大。其中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路在胞內(nèi)Ca2+升高誘導的心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵性的作用。細胞內(nèi)Ca2+濃度的升高可以激活CaN，繼而使胞質(zhì)中活化T細胞核因子去磷酸化，去磷酸化的NFATc4通過暴露其上的核定位信號，轉位入細胞核

5、，再與心肌細胞核內(nèi)的轉錄因子如鋅指轉錄因子(GATA4)相互作用，活化多種心肌肥大的相關基因，調(diào)節(jié)心臟中ANF、BNP等肥大基因特異性表達，導致心肌肥大。
　　 研究表明，TNF-α能通過干擾心肌細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)，降低鈣瞬變從而抑制心肌細胞收縮，但TNF-α對心肌細胞[Ca2+]i的影響尚不明確。
　　 Pep 3(LRENECVS)是本實驗室根據(jù)Ⅰ型TNF-α受體(TNF-R1)細胞外區(qū)域亞功能域CR

6、D4區(qū)域設計，從多個序列中篩選出的一條優(yōu)選小肽(Pep 3序列已申請國家專利保護，申請?zhí)枺?00810218732.2)，是一種多肽類TNF-α受體拮抗劑，前期研究表明其能夠顯著抑制TNF-α和TNF-R1的結合。本文設想TNF-α能夠通過Ca2+-CaN-NFATc4信號通路誘導心肌細胞肥大，而Pep 3能抑制TNF-α的這種作用，從而為開發(fā)新型抗心衰藥物提供理論導向。
　　 本課題分兩部分進行。
　　 第一部分建立T

7、NF-α誘導培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞肥大模型，確定刺激的濃度和時間。
　　 第二部分采用上述細胞模型觀察Pep 3是否有抑制TNF-α誘導的心肌細胞肥大的作用，并探討其可能的作用機制。
　　 第一節(jié)、TNF-α誘導乳鼠心肌細胞肥大模型的建立研究目的建立TNF-α誘導培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞肥大模型。
　　 研究方法：
　　 1.采用本室建立的改良法培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞。
　　 2.采用熒光定量PCR檢測

8、肥大基因ANF和BNP mRNA表達水平。
　　 3.倒置相差顯微鏡觀察刺激后心肌細胞表面積的變化并統(tǒng)計分析。
　　 結果：細胞表面積測定結果顯示，TNF-α(10-50ng/ml)可以濃度依賴性地增加乳鼠心肌細胞表面積，其中25 ng/ml有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，vs空白對照組)。TNF-α(25 ng/ml)可以時間依賴性地誘導心肌表面積增加，刺激24小時最為明顯(P＜0.05，vs空白對照組)。熒光定量PCR結

9、果顯示，TNF-α(25 ng/ml)可以時間依賴性地誘導心肌細胞ANF和BNP mRNA表達水平升高，12小時和24小時有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，vs空白對照組)，而48小時恢復至正常水平。
　　 結論：本文成功建立TNF-α誘導培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細胞肥大模型，模型的建立條件為：25 ng/ml TNF-α作用于心肌細胞24小時。
　　 第二節(jié)、Pep 3對TNF-α誘導乳鼠心肌細胞肥大的影響及相關信號通路研究。<

10、br>　　 研究目的：觀察Pep 3對TNF-α誘導乳鼠心肌細胞肥大反應的作用，并探討TNF-α誘導心肌肥大反應的機制。
　　 研究方法：
　　 1、采用MTT的方法檢測細胞存活率觀察在乳鼠心肌細胞使用Pep 3的安全濃度。
　　 2、實驗分為五組，分別為空白對照組、細胞肥大模型組、Pep 3低劑量組、Pep 3中劑量組、Pep 3高劑量組。空白對照組不予以任何刺激，細胞肥大模型組以25 ng/ml TNF-α

11、刺激，其余三組分別以30μM、60μM和120μM的Pep 3與25 ng/ml TNF-α室溫預孵育1小時后進行刺激。
　　 3、通過倒置相差顯微鏡觀察觀察細胞表面積和熒光定量PCR方法觀察TNF-α刺激后心肌細胞的肥大反應以及Pep 3對其的影響，觀察Pep 3是否具有抑制心肌細胞肥大的作用。
　　 4、以Fluo-4/AM為探針，采用激光共聚焦顯微鏡(confocol microscopy)檢測心肌細胞[Ca2+]

12、i和鈣瞬變情況，探討Pep 3抑制TNF-α誘導的心肌細胞肥大是否與Ca/2+作用相關。
　　 5、采用熒光定量PCR和Western blot方法檢測各組細胞CaN的表達，免疫熒光方法檢測NFATc4的核轉位情況，探討Pep 3抑制TNF-α誘導的心肌細胞肥大作用是否和CaN-NFATc4通路有關。
　　 結果：
　　 1、3 μM-270 μM的Pep 3對乳鼠心肌細胞活力沒有顯著影響。
　　 2、2

13、5 ng/ml TNF-α作用24小時可顯著誘導心肌細胞表面積的增大[(1.78±0.2)倍，P＜0.05，vs空白對照組]，而Pep 3在30 μM-120 μM范圍內(nèi)以濃度依賴性方式抑制了抑制了TNF-α誘導的心肌細胞表面積增大[30 μM，-93.8％，P＞0.05；60 μM，-73.0％，P＜0.05；120 μM，-69.1％，P＜0.05，vs模型組]。同時，熒光定量PCR的結果顯示，25 ng/ml TNF-α顯著誘導了

14、ANF、BNP mRNA在心肌細胞的表達[分別為(2.43±0.17)倍和(2.77±0.12)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，而Pep 3預處理1小時以濃度依賴性的方式阻止了TNF-α的這種作用(30 μM，-87.1％，P＞0.05；60 μM，-73.2％，P＜0.05；120μM，-51.4％和30μM，-90.8％，P＞0.05；60 μM，-57.8％，P＜0.05；120μM，-48.6％，vs模型組，P＜0.05)。

15、
　　 3、25 ng/ml TNF-α作用于心肌細胞30分鐘，可升高舒張期細胞內(nèi)Ca2+濃度[(1.41±0.26)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，Pep 3預處理1 h抑制了TNF-α所致的Ca2+濃度升高(30 μM，-108％，P＞0.05；60 μM，-72.3％，P＜0.05；120μM，-67.8％，vs模型組，P＜0.05)。
　　 4、25 ng/ml TNF-α作用于心肌細胞30分鐘，可使心肌細胞

16、鈣瞬變降低，Pep 3預處理1小時抑制了TNF-α的這種作用。
　　 5、25 ng/ml TNF-α刺激24小時后CaN mRNA表達較對照組明顯增加[(1.81±0.12)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，Pep 3預處理1小時以濃度依賴性方式抑制了TNF-α的這種作用(30 μM，-97.9％，P＞0.05；60 μM，-87.3％，P＜0.05；120 μM，-71.3％，vs模型組，P＜0.05)；CaN蛋白表達亦明

17、顯增加[(1.77±0.06)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，Pep 3預處理1小時同樣抑制了TNF-α的這種作用(30 μM，-98.2％，P＞0.05；60μM，-86.5％，P＞0.05；120 μM，-65.0％，vs模型組，P＜0.05)。
　　 6、TNF-α刺激1小時后心肌細胞中NFATc4開始進入細胞核。隨著刺激時間延長，發(fā)生核轉位的細胞數(shù)量增加，刺激3小時最為明顯。Pep 3預處理1小時阻止了TNF-α誘導