1、目的：構建含糞腸球菌(Enterococcus faecalis,E.faecalis)ace基因的重組載體，在大腸桿菌M15中進行誘導表達，純化表達產物并進行免疫活性分析，研究Ace蛋白在E.faecalis對膠原蛋白及HeLa細胞黏附過程中的作用，為探索Ace蛋白生物學功能及研發(fā)快速診斷試劑盒提供實驗依據。 方法：用Premier Primer 5.0引物設計軟件分析E.faecalis的ace基因序列，設計特異性引物，以E

2、.faecalis標準株E.faecalis JH2-2為模板進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增ace基因，將其亞克隆入原核表達載體pQE30中, 構建重組質粒pQE30/Ace，然后轉化至表達宿主菌M15中進行誘導表達，利用SDS-PAGE和Western blot進行分析和鑒定表達結果，Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白，BCA法測定純化蛋白濃度。將純化的Ace重組蛋白（rAce）免疫新西蘭兔，用所得抗體對rAce的免疫活性進行分析。用

3、熒光素FITC標記E.faecalis JH2-2進行黏附實驗及黏附抑制實驗，免疫熒光顯微鏡觀察結果。 結果：PCR擴增得到大小約930bp的目的片斷；構建的重組質粒經PCR、雙酶切鑒定和測序鑒定證明其中插入片段為ace目的基因，測序結果與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE分析顯示，在IPTG誘導下，重組工程菌表達了一相對分子質量(Mr)約為37kDa的目的蛋白條帶，目的蛋白在菌體細胞內主要以可溶性蛋白形式存在；

4、經Ni-NTA親和純化獲得了較高純度的重組蛋白；Western-blot檢測其能與6×His單克隆抗體發(fā)生特異性反應。利用純化的rAce免疫新西蘭兔，間接ELISA法測定兔免疫血清特異性抗體效價在1:16 000以上；從E.faecalis 細胞壁提取的Ace蛋白能與rAce免疫兔抗血清識別。黏附實驗顯示E.faecalis JH2-2 能夠黏附于膠原蛋白Ⅰ及HeLa細胞表面；黏附抑制試驗顯示rAce多克隆抗體具有抑制46℃培養(yǎng)的E.f

5、aecalis JH2-2對膠原蛋白Ⅰ及HeLa細胞的黏附作用，這種抑制作用隨著血清稀釋度的增加而減弱。 結論： 1. 成功構建了pQE30/Ace原核表達載體，將其轉化至E.coliM15后表達出了一相對分子量（Mr）約為37kDa的重組蛋白； 2. Ace重組蛋白具有較好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產生高效價的特異性抗體，并具有良好的免疫反應性，有望應用于E.faecalis快速診斷中； 3. Ace是