1、研究目的：
　　膽固醇的逆轉運是機體排除過多膽固醇的唯一途徑，對維持生物體膽固醇代謝穩(wěn)態(tài)具有重要意義，也是目前認為機體對抗動脈粥樣硬化發(fā)生的主要機制之一。膽固醇逆轉運的影響因素及調控機制多而復雜。ATP結合盒轉運子A1(ABCAl)是一種整合膜蛋白，它以ATP為能源，促進細胞內游離膽固醇和磷脂流出至細胞外貧脂的ApoAⅠ。ABCA1基因突變的Tangier病患者和ABCA1基因敲除的小鼠均表現(xiàn)出細胞內膽固醇外流障礙。ABCA1首先

2、介導泡沫細胞內的磷脂流出，磷脂流出后與細胞外ApoAⅠ結合，形成盤狀復合物;在其誘導下，使細胞內的游離膽固醇流出并與該復合物相結合，從而形成前β-HDL，接著在卵磷脂膽固醇酯酰轉移酶作用下，前β-HDL轉變?yōu)槌墒斓腍DL。因此，ABCA1是調節(jié)細胞內膽固醇外流關鍵的限速蛋白，ABCA1在膽固醇逆轉運過程中發(fā)揮了非常關鍵的作用。
　　ABCA1在體內的表達受多個因素所調節(jié)，研究較多的是核受體家族，如過氧化物酶體增殖激活型受體(PPA

3、Rs)、肝孤兒受體(LXR)、視黃醇X受體(RXR)等，它們均可在轉錄水平調控ABCA1的表達。PPARs包括PPAR-α，PPAR-β和PPAR-γ三種亞型。其中PPAR-γ是核受體家族最重要的成員之一，現(xiàn)在認為PPAR-γ參與調節(jié)巨噬細胞脂質代謝和細胞分化。PPAR-γ作為一個關鍵的轉錄調節(jié)因子，可調控多個介導膽固醇轉運的基因表達。LXR是核受體超家族成員，有LXRα和LXRβ兩種亞型。LXRα可調節(jié)肝臟、巨噬細胞和小腸內膽固醇代謝

4、相關的許多靶基因。研究證實，LXR激動劑可上調巨噬細胞ABCA1的表達，導致細胞內膽固醇的流出。
　　丹酚酸B(Salvianolic acid B，Sal B)是提取的丹參干燥根及根莖中的有效成分。Sal B為一分子咖啡酸和三分子丹參素縮合而成，是丹參活性最強的水溶性提取物之一，也是研究較多的丹參酚酸。以往的研究已證實，Sal B能改善血流動力學，降低氧化損傷和修復血管內皮功能。在過去的幾年中Sal B以及其他的丹參提取物質在中

5、國甚至有些西方國家已廣泛用于動脈粥樣硬化性血管疾病包括冠心病和中風。Sal B能夠清除羥自由基，超氧陰離子自由基，抑制脂質過氧化，因而被視為一種抗氧化劑。Sal B被證實是一種有效的CD36拮抗劑，抑制巨噬細胞依賴于CD36對修飾型低密度脂蛋白的攝取。Sal B能抑制血小板的聚集和活化，通過降低基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9穩(wěn)定粥樣斑塊改善預后。在飲食誘導的高膽固醇血癥兔模型中，Sal B能抑制LDL的氧化修飾，降低血漿膽固醇水平，

6、改善內皮損傷和動脈粥樣硬化的嚴重程度。
　　上述研究結果表明，膽固醇逆轉運被證實是脂質代謝HDL防止動脈粥樣硬化的主要機制。Sal B在脂質代謝和抗動脈粥樣硬化過程中扮演了重要角色。然而，目前關于Sal B對膽固醇流出影響的研究較少，本研究以PMA誘導THP-1源性巨噬細胞為研究對象，檢測Sal B對膽固醇流出的影響。在蛋白和mRNA水平測定THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達，及PPAR-γ和LXRα蛋白水平的表達。采用PPAR

7、-γ和LXRα激動劑及拮抗劑檢測Sal B誘導的促進脂質外排過程中的作用，從而澄清Sal B與膽固醇流出的關系及其可能的作用機制。
　　研究方法：
　　1.THP-1源性巨噬細胞的培養(yǎng):人THP-1單核細胞在160nmol/mlPMA作用72h，誘導THP-1細胞分化生成巨噬細胞。
　　2.THP-1源性巨噬細胞在50mg/L ox-LDL和1.0μCi/ml[3H]-膽固醇作用24h，誘導生成負載膽固醇的巨噬細胞。<

8、br>　　3.Sal B(0，0.1，1 and10μM)作用于荷脂的THP-1源性巨噬細胞24h，及10μM Sal B作用于細胞0、3、6、12、24 h。液體閃爍法測定放射性物質進出細胞，評價Sal B對膽固醇流出的影響。
　　4.Sal B作用于THP-1源性巨噬細胞，Real-time PCR方法檢測ABCA1 mRNA水平的表達;Western blot方法檢測ABCA1蛋白水平的變化。
　　5.Sal B作用于

9、THP-1源性巨噬細胞，Western blot方法檢測PPAR-γ和LXRα蛋白水平的表達。
　　6.PPAR-γ和LXRα激動劑及拮抗劑分別與Sal B共同作用于THP-1源性泡沫細胞24h，Real-time PCR方法檢測ABCA1 mRNA水平的表達;Western blot方法檢測ABCA1蛋白水平的變化。
　　7.PPAR-γ和LXRα激動劑及拮抗劑分別與Sal B共同作用于荷脂THP-1源性巨噬細胞24h，測

10、定膽固醇流出率。
　　研究結果：
　　1.Sal B對負載膽固醇THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出率的影響:在ApoA-Ⅰ，HDL2或HDL3存在情況下，用不同濃度的Sal B(0，0.1，1 and10μM)處理荷脂的THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比，1μM Sal B能促進膽固醇流出至ApoAⅠ和HDL2(P＜0.05)，10μM Sal B促進膽固醇流出至ApoAⅠ和HDL2約是對照組2.5倍和3.2倍(P＜0.

11、01)。同時，10μMSal B也能促進膽固醇流出至HDL3(P＜0.05)。
　　10μM Sal B處理負載膽固醇的THP-1源性巨噬細胞0、3、6、12、24 h。結果顯示，6h之內Sal B不能發(fā)揮對膽固醇流出至三種介質的作用;12h后Sal B明顯增強膽固醇流出(P＜0.05)，培養(yǎng)24h后可顯著增強膽固醇流出至ApoAⅠ和HDL2(P＜0.01)。
　　以上結果表明Sal B以濃度和時間依賴模式促進THP-1源性

12、巨噬細胞膽固醇外排至ApoAⅠ、HDL2和HDL3。
　　2.Sal B對THP-1源性巨噬細胞ABCA1在蛋白和mRNA水平表達的影響:不同濃度的Sal B(0，0.1，1 and10μM)處理THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比較，0.1μM Sal B處理THP-1源性巨噬細胞后ABCA1蛋白和mRNA水平表達無明顯改變，而1μM(P＜0.05)和10μM(P＜0.01) Sal B處理后，ABCA1蛋白和mRNA水平表

13、達均明顯提高。
　　用10μM Sal B處理THP-1巨噬細胞0、3、6、12、24 h。結果顯示，與對照組比較，10μM Sal B處理3h和6h對ABCA1蛋白水平表達無明顯影響(P＞0.05)。10μM Sal B刺激12h和24h ABCA1蛋白水平表達明顯升高(P＜0.01)。ABCA1 mRNA水平表達在10μM Sal B處理達6h后明顯升高(P＜0.01)。
　　上述結果表明，Sal B可以濃度和時間依賴模

14、式增強THP-1巨噬細胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表達。
　　3.Sal B對THP-1源性巨噬細胞PPAR-γ和LXRα在蛋白水平表達的影響:不同濃度的Sal B(0，0.1，1 and10μM)處理THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比較，1μM和10μM Sal B處理后PPAR-γ和LXRα的表達顯著增加(P＜0.01);0.1μM SalB處理后PPAR-γ和LXRα的表達無明顯改變(P＞0.05)。

15、　　4.PPAR-γ和LXRα激動劑及拮抗劑對Sal B誘導THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達的影響:PPAR-γ拮抗劑GW9662(20μM)和LXRα拮抗劑GGPP(5μM)均顯著抑制Sal B誘導的ABCA1在蛋白和mRNA水平的表達(P＜0.01)，而PPAR-γ激動劑羅格列酮(1μM)和LXRα激動劑GW3965(5μM)大大增強ABCA1在蛋白和mRNA水平的表達(P＜0.01)。
　　5.PPAR-γ和LXRα激動

16、劑及拮抗劑對Sal B誘導荷脂的THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出的影響:PPAR-γ和LXRα激動劑及拮抗劑分別與SalB共同孵育負載膽固醇的THP-1源性巨噬細胞24h。與對照組比較，SalB顯著促進膽固醇流出至ApoAⅠ(P＜0.01)、HDL2(P＜0.01)和HDL3(P＜0.05)。PPAR-γ拮抗劑GW9662和LXRα拮抗劑GGPP均明顯抑制Sal B誘導的膽固醇流出(P＜0.01)。PPAR-γ激動劑羅格列酮和LXRα激

17、動劑GW3965均明顯增強Sal B誘導膽固醇流向ApoAⅠ、HDL2和HDL3(P＜0.01)。
　　研究結論：
　　1.Sal B可以時間和濃度依賴模式促進體外培養(yǎng)的負載膽固醇的THP-1源性巨噬細胞膽固醇流出。
　　2.Sal B可以濃度和時間依賴模式增強THP-1巨噬細胞ABCA1在蛋白水平和mRNA水平的表達。
　　3.Sal B促進THP-1源性巨噬細胞ABCA1表達是通過PPAR-γ和LXRα途徑。