1、第二軍醫(yī)大學博士學位論文游離的gp190胞內功能片段對白血病細胞的生長調節(jié)姓名：王靜申請學位級別：博士專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學指導教師：劉厚奇20090501第二軍醫(yī)大學博士學位論文的研究，說明在生理狀態(tài)下7secretase可能發(fā)揮著切割gpl90產(chǎn)生游離C末端的作用。最后我們進行了動物實驗，成功建立了白血病裸鼠動物模型。通過對外周血、骨髓和臟器的檢測，說明190CT3移植組在裸鼠體內仍然呈現(xiàn)了分化趨勢，侵襲轉移的惡性程度降低。因此

2、，通過本課題的研究，我們明確了gpl90C末端不同功能域190CT23、190CT3在細胞內游離存在時，促進白血病細胞分化，激活信號分子STAT3；這種游離多肽在生理狀態(tài)下也可能存在。本研究旨在探索受體細胞內區(qū)單一功能域的應用價值，誘導白血病細胞成熟分化。第一部分、重組人gpl90胞內功能片段的白血病細胞株的獲得與鑒定方法：(1)酶切初步鑒定已構建的重組質粒pcDNA30190C123、pcDNA30190C13，進一步測序；構建重組質

3、粒pcDNA30MUT：通過引物重疊PCR法設計定點突變，在引物中置換突變堿基，將190Cq3蛋白序列中三處YxxQ基團的酪氨酸(Y)位點突變?yōu)楸奖彼?F)，將突變后的基因序列插入載體pcDNA30。(2)將重組質粒用FuGENE6脂質體轉染人白血病細胞株HL60和K562，G418梯度篩選陽性克隆15d，挑選生長旺盛的克隆擴增，設轉染pcDNA30空質粒載體和野生型HL60和K562細胞為對照組。鑒定轉染后細胞內gpl90羧基末端(

4、Cterminal)的表達：用免疫細胞化學，蛋白印跡和RTPCR的方法進行蛋白水平的半定量檢測，確定穩(wěn)定表達目的基因的細胞株，以備后面實驗使用。(3)蘇木精染色，顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)；細胞計數(shù)繪制生長曲線；金黃色葡萄球菌實驗檢測細胞吞噬功能；流式細胞術檢測細胞表面成熟粒單核細胞相關抗原的表達。結果：(1)BamHI、XbaI雙酶切重組質粒pcDNA30190Cq23、pcDNA30190CT3，電泳紫外燈下觀察可見大小相符的目的片段

5、，測序結果與Genbank核酸序列數(shù)據(jù)庫中LIFR序列(X61615)比對，完全一致。190Cq23全長597個堿基，190CT3全長357個堿基。對190CT3定點突變，獲得339bpDNA片段，經(jīng)BamHI、XbaI雙酶切連接重組入質粒pcDNA30，雙向測序后與GenbaIll【數(shù)據(jù)庫中LIFR序列(X61615)比對，原190CT3片段的三處編碼酪氨酸的cDNA序列TAT正確置換為編碼苯丙氨酸的TTC，成功獲得重組pcDNA30

6、MUT的真核表達質粒。(2)經(jīng)G418篩選得到重組190CT23、190CT3、MUT的HL60和K562細胞和空質粒轉染細胞。用免疫印跡法檢測LIFR，于20KD、15KD處見目的蛋白條帶，選取穩(wěn)定表達的細胞株進行下一步實驗。蘇木精染色，光鏡下觀察細胞形態(tài)，結果顯示190CT23和190CT3誘導后，細胞的桿狀核與分葉核增加。統(tǒng)計學分析分葉核比例：190CT3190Cr23組，P001，組間差別有意義。(3)細胞計數(shù)，繪制生長曲線，1