1、Neuropilins(NRPs)是一個新型的多功能受體，通過與3型semaphorins的結合，能夠介導神經系統(tǒng)的發(fā)育，同時，通過與VEGF(vascular endothelialgrowth factor)家族的結合，介導血管的生成。NRPs家族包括NRP-1和NRP-22個成員，其中NRP-1在神經和心血管的發(fā)育中起到了關鍵性的作用；而NRP-2則在神經和淋巴管的生長過程中發(fā)揮作用。更重要的是，NRPs高表達于多種腫瘤細胞表面，

2、并參與腫瘤的生長和腫瘤血管的生成。研究顯示，阻斷NRP-1與VEGF的結合，既能直接抑制腫瘤的生長，也能通過抑制腫瘤血管的生成間接抑制腫瘤生長。因此，NRP-1被認為是繼VEGF后又一重要的，也是最有希望的抗腫瘤新靶標。本文通過基因工程技術獲取了NRP-1 b1b2結構域的基因序列并表達蛋白，繼而利用雜交瘤技術獲得特異性針對此結構域的單克隆抗體。
　　 我們利用RT-PCR技術獲取NRP-1 b1b2結構域的基因，并將其克隆至質

3、粒pET22b(+)，獲得原核表達載體NRP-1 b1b2-pET22b(+)；重組質粒轉化至E.coli Rosetta中，IPTG誘導表達，優(yōu)化IPTG誘導劑量和誘導時間，確定目的蛋白的高效表達條件。鎳親和層析柱和HPLC純化目的蛋白，并采用尿素梯度復性緩沖液透析復性。以復性蛋白免疫小鼠，取其脾細胞進行細胞融合，經過多次克隆篩選，獲得NRP-1 b1b2單克隆抗體克隆細胞株，繼而腹水生產并純化抗體。ELISA實驗鑒定抗體的亞型和滴度

4、；Western blot、免疫共沉淀和熒光免疫組化實驗鑒定抗體的特異性；DNAstar軟件和DiscTope軟件對NRP-1b1b2的表位進行預測并通過競爭性ELISA和免疫斑點實驗對其進行鑒定。
　　 結果表明，我們獲得序列正確的重組質粒NRP-1 b1b2-pET22b(+)，其在E.coli Rosetta中主要以包涵體的形式高效表達；通過對誘導條件的優(yōu)化，確定在終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導條件下，最適誘導

5、時間為4 h；經過2次融合，共篩選1500株雜交瘤細胞，獲得57株陽性株，選取其中滴度最高的1株進行抗體的腹水生產；ELISA實驗結果顯示純化抗體的亞型為IgG1，且滴度達到了1:32000； Western b1ot、免疫共沉淀和熒光免疫組化實驗結果顯示抗體不僅能夠正確識別NRP-1b1b2融合蛋白，同時也能正確識別生理狀態(tài)下全長的NRP-1；NRP-1b1b2多肽片段的競爭性ELISA和免疫斑點實驗結果顯示抗體與含線性抗原表位的NR