1、目的：
　　明確TIM-4與T2D發(fā)生的相關(guān)性，并初步探討其作用機(jī)制，為T2D的診斷、治療提供新的思路;闡明TIM-4對(duì)NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)效應(yīng)，鑒定其新型生物學(xué)功能，為NLRP3炎性體相關(guān)疾病的干預(yù)提供新的靶點(diǎn);構(gòu)建人TIM-4啟動(dòng)子報(bào)告基因載體并檢測(cè)其活性，為TIM-4的表達(dá)調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIM-4 mRNA的表達(dá)顯著升高
　　根據(jù)T2D的診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集

2、51例T2D患者及39例健康對(duì)照抗凝外周靜脈血，F(xiàn)icoll分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，TRIZOL提取總RNA，利用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TIM-4 mRNA的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析T2D患者與健康對(duì)照之間的差異。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2D患者TIM-4mRNA的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組，表明TIM-4在T2D進(jìn)程中可能發(fā)揮潛在的作用。
　　2.T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TIM4mRNA水平與hsCRP和IL-1

3、β相關(guān)
　　在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在SLE病人中TIM-4 mRNA的表達(dá)水平與炎癥因子TNF-α呈正相關(guān)，表明前炎性因子可能誘導(dǎo)TIM-4的表達(dá)。在本研究中，收集T2D患者血清，ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-18及hsCRP的水平，進(jìn)一步分析TIM-4 mRNA水平與上述炎癥因子的相關(guān)性。
　　與前期結(jié)果一致，T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的TIM-4 mRNA水平與hsCRP呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明TIM-4表達(dá)的增加可能是被

4、增高的炎性因子誘導(dǎo)所致。然而發(fā)現(xiàn)，外周血單個(gè)核細(xì)胞TIM-4 mRNA水平和血清IL-1β呈負(fù)相關(guān)，與IL-18也呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，并且IL-1β與IL-18顯著正相關(guān)，提示TIM4可能抑制IL-1β及IL-18的產(chǎn)生。
　　3.T2D患者中血清IL-1β水平與HbAlc呈正相關(guān)
　　為明確T2D患者中IL-1β升高的重要作用，我們進(jìn)一步分析了IL-1β與HbAlc、LDL、HDL以及其它臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，T2D患者I

5、L-1β水平與HbAlc呈正相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)1L-1β與其它指標(biāo)的相關(guān)性，表明高水平的IL-1β可能加重T2D進(jìn)程。
　　4.T2D病人中TIM-4 mRNA與HbAlc和LDL呈負(fù)相關(guān)
　　我們進(jìn)一步分析了TIM-4 mRNA與代謝指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIM-4mRNA與LDL呈負(fù)相關(guān)，并與HbAlc有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但未發(fā)現(xiàn)TIM-4與禁食血糖、總膽固醇、HDL膽固醇、甘油三酯的相關(guān)性，這些結(jié)果表明TIM-4在T2D的進(jìn)程

6、中可能發(fā)揮保護(hù)作用。
　　5.載體構(gòu)建
　　以pcDNA3.0為骨架載體，以pcDNA3.0-mTIM-4為模板，構(gòu)建攜帶HA標(biāo)簽的小、鼠Tim-4全基因表達(dá)載體pcDNA3-mTim-4-HA，以pcDNA3-hTIM-4-HA為模板，利用定點(diǎn)突變?cè)噭┖袠?gòu)建mucin結(jié)構(gòu)域缺失的突變載體pcDNA3-hTIM-4(△mucin)-HA，以酶切、測(cè)序鑒定載體的正確性，Western blot檢測(cè)其表達(dá)。經(jīng)blast分析，所構(gòu)

7、建載體測(cè)序結(jié)果與目的基因序列完全一致， Western blot可檢測(cè)到標(biāo)簽蛋白HA的表達(dá)。
　　6.NLRP3炎性體活化細(xì)胞模型的建立
　　將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，利用終濃度為1μg/ml的LPS刺激4h，再以5 mM ATP刺激30 min后，離心，取細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA檢測(cè)IL-1β的水平。結(jié)果表明，經(jīng)LPS、ATP刺激后，上清中IL-1β的水平明顯升高，表明成功建立了NLRP3炎性體的活化細(xì)胞模

8、型。
　　將HEK293細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，取pDsRed-monomer-Cl-human ASC5 ng、pDsRed-monomer-C1-human caspase-15 ng、pcDNA3-hNLRP315 ng、pDsRed-monomer-Cl-human IL-1β150 ng，混勻，利用Lipofectin2000共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，旨在建立NLRP3炎性體重構(gòu)模型。轉(zhuǎn)染48 h后，收取細(xì)胞及其上清，E

9、LISA檢測(cè)上清中IL-1β，RT-PCR檢測(cè)各組分mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，RT-PCR可檢測(cè)到NLRP3炎性體各組分mRNA的表達(dá)，ELISA結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染組產(chǎn)生較高水平的IL-1β，提示成功建立NLRP3炎性體的重構(gòu)體系。
　　7.利用腹膜炎模型證實(shí)TIM-4在體內(nèi)對(duì)NLRP3炎性體的抑制效應(yīng)
　　利用6-8周齡、雄性C57BL/6腹腔注射LPS(20 mg/kg)，2h后再腹腔注射AL(OH)3800μg，4h后收集

10、腹腔液，ELISA檢測(cè)IL-1β的水平，結(jié)果顯示LPS/AL(OH)3注射組腹腔液中可檢測(cè)到較高水平的IL-1β，表明腹膜炎模型構(gòu)建成功。
　　將60μ g pcDNA3-mTim-4 HA或空載體pcDNA3質(zhì)粒DNA與轉(zhuǎn)染試劑PEI按氮磷比10∶1混合制備200 u l的混合物，室溫孵育15 min。將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為兩組，每組3只，一組尾靜脈注射pcDNA3-mTim-4-HA質(zhì)粒，另一組尾靜脈注射空載體pcDNA

11、3質(zhì)粒，質(zhì)粒注射24 h后，兩組小鼠均腹腔注射20 mg/kg LPS及800μg AL(OH)3，ELISA檢測(cè)腹腔液IL-1β的水平，RT-PCR檢測(cè)Tim-4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示Tim-4質(zhì)粒注射組IL-1β的水平顯著低于空載體對(duì)照組，Tim-4質(zhì)粒注射組腹腔細(xì)胞中Tim-4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。
　　將Tim-4 siRNA慢病毒或?qū)φ詹《荆?×107U/0.1ml/只）經(jīng)尾靜脈注射入C57BL/6小鼠

12、體內(nèi)，7d后，同上構(gòu)建腹膜炎模型并檢測(cè)IL-1β及Tim-4 mRNA及其蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示Tim-4 siRNA組腹腔液中IL-1β的水平顯著高于對(duì)照組，并且Tim-4 siRNA注射組脾及肝單個(gè)核細(xì)胞中Tim-4 mRNA的表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，流式細(xì)胞術(shù)也檢測(cè)到脾細(xì)胞及肝單個(gè)核細(xì)胞中Tim-4表達(dá)降低。
　　8.TIM-4對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體表達(dá)的影響
　　利用polyplus將TIM-4 siRNA及對(duì)照N

13、C siRNA分別轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，分別利用RT-PCR檢測(cè)TIM-4、NLRP3、ASC、caspase-1及IL-1β mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，TIM-4 siRNA轉(zhuǎn)染組TIM-4表達(dá)水平降低，而且TIM-4 siRNA組ASC的表達(dá)水平升高。
　　小鼠腹腔注射6％淀粉溶液，72 h后常規(guī)分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，轉(zhuǎn)染小鼠Tim4 siRNA或?qū)φ?，轉(zhuǎn)染48 h后，檢測(cè)Tim-4、NLRP3炎性體各組分的表達(dá)

14、。結(jié)果顯示，Tim-4 siRNA轉(zhuǎn)染組Tim-4 mRNA的表達(dá)水平降低，而且Tim-4 siRNA組IL-1β mRNA的表達(dá)水平升高。
　　9.TIM-4啟動(dòng)子的構(gòu)建及活性檢測(cè)
　　以外周血基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增、構(gòu)建人TIM-4啟動(dòng)子pGL3-hTIM-4(-1241～+49)，并酶切、測(cè)序鑒定。用HEK293細(xì)胞以1.5×105個(gè)/ml的密度鋪于48孔培養(yǎng)板中，啟動(dòng)子質(zhì)粒DNA500 ng/孔、pGL-TK

15、10 ng/孔用脂質(zhì)體Lipo2000法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，利用熒光計(jì)數(shù)儀檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)啟動(dòng)子與內(nèi)參pGL TK Renilla的熒光素酶活性，取得并比較其ratio值。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析，pGL3-hTIM-4（-1241～+49）構(gòu)建成功，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示，構(gòu)建的啟動(dòng)子具有良好活性。
　　結(jié)論：
　　1.T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIM-4 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常人，T2D患者TIM-4

16、mRNA水平與外周血hsCRP呈正相關(guān)，但與IL-1β、LDL呈負(fù)相關(guān)，并與IL-18、HbAlc呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，而T2D患者IL-1β與HbAlc呈正相關(guān)，提示TIM-4可能通過(guò)影響IL-1β產(chǎn)生參與T2D進(jìn)程。
　　2.TIM-4可抑制NLRP3炎性體的活化，但TIM-4發(fā)揮抑制效應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及分子機(jī)制尚不清楚，另外發(fā)現(xiàn)，TIM-4可抑制ASC、IL-1β mRNA的表達(dá)，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
　　3.獲得具有良

17、好活性的人TIM-4啟動(dòng)子。
　　創(chuàng)新點(diǎn)及意義
　　本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明TIM-4可抑制NLRP3炎性體的活化，另外發(fā)現(xiàn)T2D患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TIM-4 mRNA水平顯著升高并與IL-13、LDL水平顯著負(fù)相關(guān)，并與HbAlc、IL-18呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，推測(cè)TIM-4可能通過(guò)抑制NLRP3炎性體的活化參與T2D進(jìn)程。該研究闡明了TIM-4新型生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)TIM-4表達(dá)水平與T2D發(fā)生有關(guān)，本文研究結(jié)果為T2D的發(fā)病機(jī)