1、c-Abl是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl在細胞內(nèi)的同源基因,所編碼的蛋白c-Abl屬于非受體酪氨酸激酶,在細胞核和細胞質中廣泛分布,具有重要的生物學功能。c-Abl通過與其底物相互作用,并使其相互作用蛋白酪氨酸磷酸化而激活一系列重要的信號轉導途徑,參與調控細胞黏附遷移、細胞增殖與分化、細胞轉化、細胞周期和細胞凋亡、基因轉錄等過程。c-Abl在DNA損傷應激反應中具有重要的調節(jié)作用;c-Abl在RNA轉錄后加工過程中也發(fā)

2、揮著重要的調節(jié)作用。至今,c-Abl具體的下游因子及分子機制知之甚少。
　　為進一步研究c-Abl發(fā)揮功能的分子機理,實驗室前期以全長c-Abl為誘餌蛋白,采用酵母雙雜交法篩選Hela細胞cDNA庫,獲得一系列與c-Abl相互作用的靶分子,發(fā)現(xiàn)剪接因子U2AF65(U2 snRNP auxiliary factor65kDa subunit)可能與c-Abl相互作用。U2AF65作為重要的mRNA剪接因子,它與前體mRNA內(nèi)含子多

3、聚嘧啶區(qū)的特異結合是起始剪接體組裝的關鍵步驟,同時它也參與可變剪接的調節(jié)和mRNA核-質轉運。U2AF65的RS結構域與前體mRNA內(nèi)含子分支位點BPS交叉連接,使U2snRNP中的snRNA更容易與BPS結合;該結構域也作為核定位信號,在亞細胞定位和核質穿梭中起到重要的決定作用。RRM結構域識別pre-mRNA內(nèi)含子中主要由尿嘧啶組成的多聚嘧啶序列Py-tract。UHM結構域介導蛋白質之間相互作用。U2AF65的Lys15和Lys2

4、76可以發(fā)生酰羥基化并影響U2AF65的活性,進而引發(fā)某些基因的可變剪接。至今,有關U2AF65調控的研究甚少。
　　本論文在酵母雙雜交實驗的基礎上,對非受體酪氨酸激酶c-Abl與U2AF65相互作用及其在核質穿梭、mRNA轉運,可變剪接等過程中的作用進行了研究。
　　本研究通過免疫沉淀、免疫印跡及GST-pull down方法證明c-Abl和U2AF65在細胞內(nèi)和細胞外直接相互作用。c-Abl通過SH2、SH3結構域與U2

5、AF65直接結合。通過GST-pull down和點突變的方法發(fā)現(xiàn)與c-Abl結合的結構域是UHM結構域,參與結合的氨基酸殘基主要包括第414、416和423位脯氨酸。通過抗酪氨酸磷酸化抗體的免疫印跡實驗證明c-Abl可以使U2AF65酪氨酸磷酸化,U2AF65是非受體酪氨酸激酶c-Abl的磷酸化底物,但是磷酸化較弱;利用質譜分析發(fā)現(xiàn)U2AF65可能的磷酸化位點是第91位和第232位酪氨酸。進一步的研究發(fā)現(xiàn)c-Abl基本不影響U2AF6

6、5的表達。U2AF65是核質穿梭蛋白,但通常在熒光顯微鏡下它只在細胞核中被觀察到。用5、10、15Gy劑量電離輻射處理細胞,DNA損傷應激條件下,U2AF65由細胞核向細胞質轉移,轉移的程度具有劑量依賴性。隨著時間的推移,U2AF65又由細胞質向細胞核轉位。當用c-Abl抑制劑STI571處理細胞,無論是出核還是之后的入核都被抑制。當使用缺失c-Abl激酶活性的MCF-7(c-Abl K290R)細胞,發(fā)現(xiàn)U2AF65更多地定位在細胞質

7、中,以15Gy劑量的電離輻射處理之后,也沒有出現(xiàn)核質之間的轉移,說明U2AF65在細胞內(nèi)的分布和c-Abl的活性相關。c-Abl調控電離輻射介導的U2AF65的核質間的穿梭。核質之間的穿梭通常與蛋白的核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES)有關,CRM1,即exportin1,是主要的出核介導物。它與出核蛋白上的NES序列結合并將其轉運至核孔的出核部分。Leptomycin B(LMB)可特異阻斷CRM1識別NES信號從而阻斷蛋白質核

8、輸出過程。我們發(fā)現(xiàn),15Gy劑量輻射處理細胞的同時再加LMB處理2h,U2AF65沒有完全從細胞核轉移入細胞質,部分滯留在細胞核。說明U2AF65蛋白自身可能含有NES信號。經(jīng)過對U2AF65氨基酸序列的分析,在U2AF65的RRM2結構域和UHM結構域之間,發(fā)現(xiàn)一段疑似NES的特征性序列374-LCLMNMVLP-382。瞬間異核體形成實驗證明U2AF65的NES介導其出核。同時發(fā)現(xiàn),電離輻射可調控U2AF65介導的mRNA轉運,在細

9、胞接受電離輻射不同時間(2h、4h)后,細胞質中HEXIM和ZNF174基因的mRNA(其核-質轉運由 U2AF65介導)水平均升高。由于而這兩個基因編碼的蛋白質是轉錄抑制因子,說明c-Abl可能通過調控這類轉錄因子的核-質轉運調控基因轉錄。
　　最后,我們通過Affymetrix外顯子芯片,發(fā)現(xiàn)c-Abl廣泛參與的轉錄和剪接調控。由Partek軟件分析輸出差異表達基因列表,和可能發(fā)生可變剪接的基因和位點,大量基因發(fā)生了受調控的可

10、變剪接。
　　本研究通過c-Abl與U2AF65的相互作用及生物學意義研究得到如下結果:
　　c-Abl能夠直接與U2AF65相互作用;c-Abl與U2AF65UHM結構域的第414-423位氨基酸殘基結合;c-Abl能夠使U2AF65磷酸化,酪氨酸磷酸化位點分析表明U2AF65的Y91和Y232可能是磷酸化位點;c-Abl基本不影響U2AF65的表達;U2AF65是核質間穿梭蛋白,其核-質穿梭受c-Abl依賴的電離輻射調控

11、;U2AF65具有NES核輸出信號,特征性序列為LCLMNMVLP;電離輻射調控U2AF65介導的mRNA轉運;c-Abl廣泛調控基因轉錄和可變剪接。
　　通過c-Abl與U2AF65的相互作用及其生物學意義的研究,證明c-Abl非受體酪氨酸激酶與剪接因子U2AF65存在相互作用,并對c-Abl酪氨酸激酶調節(jié)U2AF65的核質穿梭和mRNA轉運,c-Abl參與調控轉錄和可變剪接的機制進行了探討。對深入認識c-Abl酪氨酸激酶在生理