1、膀胱癌是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，具有早期診斷困難，治療后容易復發(fā)的特點。盡管外科治療和化療方法不斷進步，但治療效果仍不十分滿意，且其術后的輔助治療和長期隨訪也增加了患者的醫(yī)療費用和痛苦。因此，探索膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學機制和遺傳學本質(zhì)，為膀胱癌的早期診斷及靶向性治療提供理論基礎，是臨床和科研上急需解決的重要課題。與其他惡性腫瘤一樣，膀胱癌的發(fā)生是多基因、多階段變異累積形成的病理過程。這些基因主要是癌基因、抑癌基因及錯配修復基因等

2、。隨著分子生物學的發(fā)展，原癌基因的激活和抑癌基因的失活導致細胞增殖失控及凋亡缺陷被認為是腫瘤發(fā)生的主要機制。抑癌基因功能的丟失可以通過多種途徑，DNA甲基化是除缺失和突變之外導致抑癌基因失活的第三種機制，異常甲基化可引起染色體結構、穩(wěn)定性的改變和基因表達異常，影響細胞的增殖和分化，最終導致抑癌基因表達沉默。因此，DNA甲基化被認為是腫瘤發(fā)生的關鍵事件，在腫瘤相關基因的調(diào)控以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。 Apaf-1

3、(細胞凋亡蛋白酶活化因子-1)、APC(腺瘤性結腸息肉病相關基因)是兩種重要的抑癌基因，分別在細胞凋亡和Wnt信號傳導通路調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。新近研究證實Apaf-1、APC在許多正常組織中均有表達，但是在胃癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中卻出現(xiàn)表達缺失。有關Apaf-1、APC基因的表達和啟動子甲基化狀況在泌尿系腫瘤的研究報道較少，本實驗擬通過SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法檢測膀胱移行細胞癌(BTCC)組織中Apaf-1和AP

4、C的啟動子甲基化狀態(tài)，用免疫組織化學的方法回顧性分析膀胱移行細胞癌中Apaf-1和APC的蛋白表達，并分析兩種抑癌基因的啟動子甲基化狀態(tài)和蛋白表達與膀胱癌臨床生物學行為的關系，探討膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機制，為臨床早期診斷和預后判斷提供依據(jù)，并為膀胱癌的分子治療提供新的靶點。 第一部分抑癌基因Apaf-1及APC在膀胱移行細胞癌中的表達及其臨床意義 目的：探討抑癌基因Apaf-1和APC在膀胱移行細胞癌中的表達及臨床意義。

5、 方法：收集2001年1月至2003年12月在中山大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科確診為膀胱移行細胞癌患者的臨床資料和石蠟組織標本80例，采用免疫組織化學法分析Apaf-1及APC在膀胱移行細胞癌組織標本中的蛋白表達狀況及其表達與患者的臨床病理及生存期之間的關系。以15例正常膀胱組織的石蠟標本作對照。 免疫組化染色結果判定：Apaf-1、APC的表達以染色強度和陽性細胞百分率的得分之和進行判斷：(1)染色強度：陰性為0分；弱陽性為

6、1分；陽性為2分；強陽性為3分。(2)每個標本觀察3個有代表性的高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，確定陽性細胞數(shù)所占的百分比并取它們的平均值，根據(jù)陽性細胞比例，分為陽性細胞0％為0分；<25％為1分；25％～50％為2分；>50％為3分。(1)+(2)之和等于0～3分為不表達或低表達組，4～6分為高表達組。 結果：Apaf-1在BTCC組織和正常膀胱組織中的蛋白陽性表達率分別為36.3％(29/80)和80.0％(12/15)

7、，差異分別有統(tǒng)計學意義(χ2=9.856，P=0.002)。APC在BTCC組織和正常膀胱組織中的蛋白表達率分別為47.5％(38/80)和93.3％(14/15)，差異分別有統(tǒng)計學意義(χ2=10.71，P=0.001)。Apaf-1、APC蛋白表達率均與臨床分級、分期明顯相關，隨腫瘤分級、分期的增加而降低，差異分別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而Apaf-1、APC蛋白表達率在不同性別、不同年齡、腫瘤單發(fā)與多發(fā)及有無淋巴結轉移之間的

8、比較，差異均分別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但在復發(fā)組與未復發(fā)組的比較中，Apaf-1的蛋白表達率分別為20.6％(7/34)和47.8％(22/46)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=6.276，P=0.012)，而APC的蛋白表達率分別為52.9％(18/34)和43.5％(20/46)，差異無統(tǒng)計學意義(x2=0.702，P=0.402)。Kaplan—Meier分析顯示，Apaf-1不表達或低表達組患者的平均生存時間為48.70±1.

9、58個月，中位生存時間46.5個月；高表達組為67.54±4.09個月，中位生存時間67.3個月，經(jīng)log—rank生存曲線檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.18，P=0.000)。兩組5年總生存率分別為38.7％(24/62)和72.2％(13/18)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=6.302，P=0.012)。Kaplan—Meier分析顯示，APC不表達或低表達組患者的平均生存時間為51.4±1.8個月，中位生存時間50.0個月；高表

10、達組為65.6±2.9個月，中位生存時間68.4個月，log—rank生存曲線檢驗，差異有統(tǒng)計學意義(x2=19.29，P=0.000)。兩組5年總生存率分別為40.0％(22/55)和68.0％(17/25)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=5.39，P=0.020)。生存分析表明Apaf-1、APC基因的高表達組5年生存率高，有顯著的生存優(yōu)勢(P<0.05)。 結論： Apaf-1及APC在膀胱移行細胞癌組織中的表達水平明顯降低且與

11、臨床分級、分期相關，提示Apaf-1及APC基因的表達改變在BTCC的發(fā)生、發(fā)展中可能具有重要作用。 第二部分 DNA甲基化修飾及SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術平臺的建立 目的：建立SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術平臺，為下一步實驗做準備。 方法：用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒從新鮮膀胱癌組織中提取DNA，用亞硫酸氫鹽進行甲基化修飾后純化、回收。建立標準品，倍比稀

12、釋Apaf-1、APC的標準品，以Apaf-1、APC的甲基化和非甲基化引物進行擴增，建立PCR標準曲線。檢驗標準曲線的靈敏性和特異性。 結果：構建的Apaf-1及APC標準曲線線性關系良好(擴增反應Ct值與標準品模板起始濃度的對數(shù)呈較好的線性關系)。Apaf-1的標準曲線斜率為—3.723，R2=0.999，PCR擴增效率為1.021。APC的標準曲線斜率為—3.3000，R2=1.000，PCR擴增效率為1.009，靈敏度好

13、，特異性強，達到實驗要求。 結論： SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR技術平臺建立成功，可用于下一步BTCC組織中Apaf—Ⅰ及APC啟動子甲基化狀況的樣品檢測實驗。 第三部分膀胱移行細胞癌組織中Apaf-1及APC啟動子甲基化狀況及臨床意義 目的：定量檢測Apaf-1及APC在BTCC中的啟動子甲基化水平，分析其水平與BTCC臨床生物學行為的關系，探討膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的機制。 方法：收集2006年

14、7月至2008年12月在中山大學附屬第一醫(yī)院泌尿外科行手術治療，術后病理證實為BTCC患者的組織標本36例，分別從36例新鮮膀胱癌組織及15例新鮮正常膀胱組織中提取DNA，經(jīng)亞硫酸氫鹽進行甲基化修飾后純化、回收。確定Apaf-1及APC的反應體系及條件，進行SYBR GreenⅠ實時熒光定量的擴增和檢測。每個樣本重復3次，根據(jù)CT值及樣品上樣量計算每納克(ng)DNA中Apaf-1及APC的甲基化拷貝數(shù)，析其啟動子甲基化量與患者臨床資料

15、之間的關系。 結果：Apaf-1在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的甲基化率分別為100％(36/36)和6.77％(1/15)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=46.31，P=0.000)。APC在膀胱癌組織和正常膀胱組織中的甲基化率分別為69.44％(25/36)和33.33％(5/15)，差異有統(tǒng)計學意義(x2=5.700，P=0.017)。Apaf-1及APC的甲基化量與膀胱癌的分化程度及臨床分期有明顯的相關性，隨腫瘤分級、分期的增加

16、而增加，差異分別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而Apaf-1及APC的甲基化量在不同性別、不同年齡以及腫瘤單發(fā)與多發(fā)之間的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。Apaf-1的甲基化量在初發(fā)與復發(fā)的患者之間分別為(9.02±2.80)x103 copies/ng和(11.60±3.71)x103 copies/ng，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026)，而APC的甲基化量在初發(fā)與復發(fā)的患者之間分別(2.55±2.05)x103 copies