1、背景和目的：
　　 短QT綜合征(short QT syndrome，SQTS)是一種新發(fā)現(xiàn)的，以短QT間期伴室性心動過速(室速)、心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)、陣發(fā)性心房顫動(房顫)為特征，而心臟結構正常的一類遺傳性離子通道疾病。到目前為止，已先后發(fā)現(xiàn)6個編碼鉀通道和鈣通道亞單位致病基因(KCNH2、KCNQ1、KCNJ2、CACNA1C、CACNB2b及CACNA2D1)，提示SQTS存在遺

2、傳異質性。
　　 長QT綜合征(LQTS)，是以長QT間期，室速，SCD為主要特征的另一種遺傳性心臟離子通道病。LQTS和SQTS是表型相反的兩種心臟復極化異常疾病。目前，4個導致SQTS基因(KCNQ1，KCNH2，KCNJ2及CACNA1C)的相反功能突變導致SQTS相反表型-LQTS。SCN5A基因，負責編碼心臟電壓門控鈉離子通道α亞基-Nav1.5。已證實，SCN5A基因功能獲得突變導致LQTS。然而，迄今為止，尚無SC

3、N5A基因突變在LQTS相反表型-SQTS中的報道。
　　 據(jù)目前資料信息，除了國人SQTS中發(fā)現(xiàn)KCNH2基因突變報道外，系統(tǒng)性對國人SQTS的研究報道罕見。因此，篩查我國SQTS患者的致病基因及其突變位點，揭示國人SQTS分子遺傳機制及電生理發(fā)病機制是本研究主要目標。結合國人SQTS基因型研究結果，初步篩選有效的針對國人SQTS的抗心律失常藥物，是本研究另一個目的。
　　 材料和方法：
　　 臨床資料收集：按

4、照國際短QT綜合征診斷指南(國際心電圖指南2010)，收集QT間期縮短(QTc≤370 ms)的患者以及家族成員資料。所有患者進行詳細臨床評估，以及排除繼發(fā)性QT間期縮短因素。
　　 基因篩查：對已知SQTS致病基因(KCNQ1、KCNH2、KCNJ2、CACAN1C、CACNB2、CACNA2D1)及候選SCN5A基因的編碼區(qū)，外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)通過DNA直接測序法進行篩查。100個相同種族背景的健康個體作為對照，以鑒別罕見

5、基因突變與普通基因多態(tài)性。根據(jù)最新SQTS診斷標準，對每位患者進行評分。
　　 體外突變誘導及細胞轉染：通過定點突變誘導技術，對攜帶野生型SCN5A cDNA的pcDNA3.1+進行突變誘導。誘導突變引物如下：E428G正向引物5’gctgagaccgGggagaaggaaaagcgcttccag3’和反向引物5'ttccttctccCcggtctcagcgatggtggcttg3’；V1951L正向引物sense primer

6、5’atcgcctacTtgatgagtgagaacttctc3’和反向引物primer5'tcactcatcaAgtaggcgatgaggccctc3’；S1653S正向引物sense primer5'tgccctcatgatgtcActgcctgccctcttcaacatcg3’和反向引物5'tgaagagggcaggcagTgacatcatgagggcaaagagc3’R689H正向引物5'tgctggaaccAtctcgccca

7、gcgctacctg，反向引物5’ctgggcgagatggttccagcatggtggac。突變誘導后進行DNA測序驗證，以及排除由PCR導致非目的堿基改變。通過脂質體轉染突變型及野生型SCN5A表達質粒，至人胚腎(HEK)293細胞進行表達。
　　 細胞膜片鉗電生理分析：應用全細胞膜片鉗技術對HEK293細胞表達的離子通道功能進行檢測。分析野生型通及突變型通道的電生理特征，如電流密度、峰值，門控特性如電壓依賴的穩(wěn)態(tài)激活(SS

8、A)及穩(wěn)態(tài)失活(SSI)等。對抗心律失常藥物乙胺碘呋酮(胺碘酮)、美西律以及普羅帕酮作用突變通道的效果進行評價，以篩選經(jīng)濟、有效的SQTS治療藥物。所有記錄均在室溫下進行。
　　 結果：
　　 臨床特征：
　　 共入選符合條件無相關患者10例，QTc261-362ms，年齡15-48歲，女性患者3例。5例患者存在室速，3例患者有暈厥史，3例患者存在SCD家族史。所有患者均拒絕接受心內(nèi)電生理檢查。
　　 基

9、因型-表型：
　　 共發(fā)現(xiàn)3個SCN5A基因雜合子錯義突變，分別為E428G，V1951L和R689H。E428G突變：SCN5A基因第1283位核苷酸由A變?yōu)镚(c.1283A>G)，從而導致Nav1.5蛋白第428位氨基酸由谷氨酸變成甘氨酸。V1951L突變：SCN5A基因第5851位核苷酸由G變?yōu)門(c.5851G>T)，從而導致Nav1.5蛋白第1951位氨基酸由纈氨酸變成亮氨酸。R689H突變：SCN5A基因第2066

10、位核苷酸由G變?yōu)锳(c.2066G>A)，從而導致Nav1.5蛋白第689位氨基酸由精氨酸變成組氨酸。在相同種族背景的200個正常對照染色體中沒有發(fā)現(xiàn)上述三個突變。E428G突變存在于6號先證者，由于反復發(fā)生室速而頻發(fā)暈厥，ECG提示QTc270ms，短陣室速，頻發(fā)室早。遺憾的是，E428G先證者的家族成員拒絕提供血樣本，限制了我們對一級親屬的基因篩查以及遺傳規(guī)律的觀察。V1951L突變存在于8號先證者，反復心悸和暈厥，ECG提示QTc

11、347 ms，Ⅰ，aVL，Ⅱ，Ⅲ，aVF及V4-V6導聯(lián)早期復極化改變。其父親45歲，攜帶相同基因突變，存在心悸癥狀，但ECG正常。8號先證者及其父親同時還攜帶SCN5A基因S1653S多態(tài)性-SCN5A基因第4959位核苷酸由C變?yōu)锳(c.4959C>A)，從而導致Nav1.5蛋白第1653位氨基酸由絲氨酸變成絲氨酸。R689H突變存在于10號先證者，ECG提示QTc348ms，Ⅱ，Ⅲ，avF導聯(lián)早期復極化以及Brugada樣ECG改

12、變，無相關臨床癥狀，但存在SCD家族史。參照SQTS診斷標準，3例攜帶基因突變的先證者積分均≥4分，提示SQTS診斷。在其它先證者中均未發(fā)現(xiàn)SCN5A基因以及SOTS已知致病基因的突變。
　　 電生理特性：
　　 野生型及突變型(E428G，V1951L，S1653S，R689H)鈉通道均成功在HEK293細胞表達。與野生型相比，E428G突變型通道表現(xiàn)為顯著的ⅠNa峰值降低，穩(wěn)定狀態(tài)激活曲線與穩(wěn)定狀態(tài)失活曲線無明顯變化

13、。V1951L通道表現(xiàn)為ⅠNa密度降低趨勢，但無統(tǒng)計學意義，其它通道特性如ⅠNa峰值，電壓依賴的SSA與SSI與野生型相比，無明顯差異。S1653S通道在ⅠNa密度、峰值，SSA與SSI方面與野生型基本相同。為了解釋V1951L攜帶者明顯致心律失常表型，本研究設計了v1951L與S1653S雙變異鈉通道，有趣的是，V1951L與S1653S共轉染通道產(chǎn)生明顯的電生理特性改變，表現(xiàn)為INa密度及峰值顯著的降低，SSA與SSI超極化方向轉移

14、。R689H通道不產(chǎn)生任何電流，提示突變功能喪失。胺碘酮(50uM)、美西律(50 uM)，以及普羅帕酮(50 uM)三種藥物，只有普羅帕酮增加E428G通道電流，具有統(tǒng)計學意義。胺碘酮、美西律以及普羅帕酮均導致E428G通道電壓依賴SSA及SSI明顯向超極化方向轉移。胺碘酮，美西律對E428G突變型通道峰電流不產(chǎn)生明顯影響，而普羅帕酮能夠使E428G通道峰電流增加10％。
　　 討論和結論：
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)國人S

15、TQS患者SCN5A基因E428G、V1951L和R689H突變，及新發(fā)S1653S同義多態(tài)性。進一步通功能分析，發(fā)現(xiàn)SCN5A突變離子通道蛋白的功能喪失，提示SQTS可能與基因突變有關。本研究對這攜帶突變的先證者也進行了已知SQTS致病基因KCNQ1，KCNH2，KCNJ2，CACNA1C、CACNB2、CACNA2D1)的篩查，未發(fā)現(xiàn)基因突變。三個先證者，均表現(xiàn)為心電圖上短QT間期(分別為QTc：270ms，347ms，348ms)

16、，SCD高風險，以及無潛在的心臟結構異常。同時，獲得性的QT縮短因素也被排除，如代謝紊亂(高鉀血癥、高鈣血癥、酸中毒、洋地黃中毒、心動過速)、發(fā)熱、急性心肌梗死超急性期、甲狀腺功能亢進、自主神經(jīng)張力失衡、早期復極綜合征、藥物(ATP敏感鉀通道開放劑，最近報道的抗癲癇藥物，盧非酰胺，合成類固醇激素)等。參照最新的2011年SQTS診斷標準，E428G先證者評分為7分，V1951L和S1653S先證者為5分，R689H先證者為6分，均≥4分

17、，這表明兩個攜帶突變的先證者均完全符合SQTS診斷。綜合上述分析，表明SCN5A基因突變E428G、v1951L和S1653S及R689H均分別與SQTS疾病的明顯相關性。至此，一個新的SQTS基因型-SQTS7在中國患者中發(fā)現(xiàn)。
　　 10號先證者為無癥狀的QT間期縮短患者，通過基因篩查，發(fā)現(xiàn)存在SCN5A基因突變R689H，進一步功能學分析表明R689H通道不產(chǎn)生任何電流，提示鈉通道功能完全喪失。基因檢測排除了SQTS已知致

18、病基因突變引起該疾病表型的可能，結合SCN5A突變及其功能分析的結果，有理由認為SCN5A基因R689H突變與短QT間期表型以及SCD家族史有高度相關性。然而，本例患者一直未出現(xiàn)惡性心律失常相關癥狀，如暈厥、CA等，這表明了遺傳性心臟疾病SQTS表型的不完全外顯性。本例患者ECG除QT縮短外還表現(xiàn)為Brugada，樣心電圖改變，以及Ⅱ，Ⅲ，aVF導聯(lián)早期復極化改變，提示短QT和早期復極化并存。事實上，最近有研究也發(fā)現(xiàn)有相當比例的QT間期

19、縮短患者存在早期復極化綜合征，反之亦然。目前，對于短QT間期與早期復極化并存的機制尚不完全明了。
　　 SCN5A基因E428G突變，之前未有在遺傳性心律失常中報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)E428G突變存在于國人SQTS患者。E428G位于Nav1.5通道蛋白的DomainⅠ和DomainⅡ之間的細胞內(nèi)連接區(qū)。E428G通道在外源性表達系統(tǒng)的電生理特性表現(xiàn)為ⅠNa峰值的顯著降低，提示SCN5A基因E428G突變明顯的功能喪失作用，這與E

20、428G突變攜帶者具有明顯的致心律失常表型相符合。同時也提示Nav1.5通道蛋白DomainⅠ和DomainⅡ之間的細胞內(nèi)連接區(qū)在維持ⅠNa峰值方面發(fā)揮了重要的作用。E428G通道的門控特性如SSA曲線與SSI曲線，與野生型相比，無明顯差異。遺憾的是，E428G先證者家族成員拒絕提供家系標本，限制了我們對一級親屬致病基因篩查和遺傳方式及規(guī)律的觀察。
　　 既往文獻報道SCN5A基因V1951L突變，在LQTS以及新生兒猝死綜合征

21、患者中發(fā)現(xiàn)，在BrS患者中作為一個致病基因突變。然而，Akerman MJ等發(fā)現(xiàn)SCN5A基因V1951L作為一個普通的基因多態(tài)性，存在于健康西班牙人群，其發(fā)生率為6.7％，而在非西班牙種族的健康人群中，未發(fā)現(xiàn)V1951L變異。這表明SCN5A基因V1951L是一個相對種族特異性的基因變異。本研究在200個正常健康對照的漢族等位基因中未發(fā)現(xiàn)V1951L變異(發(fā)生率<0.5％)，提示v1951L在漢族人群中仍是少見的基因突變，這與其它研究

22、的結果是一致的。功能分析顯示V1951L通道的電生理特性與野生型相比，不存在明顯差異。這與其它研究對V1951L的功能分析結果是一致的。然而，本研究中V1951L突變攜帶者卻表現(xiàn)為明顯的致心律失常表型，這與V1951L通道無明顯功能異常的電生理特性明顯不相符合?？紤]到V1951L先證者同時攜帶SCN5A基因S1653S多態(tài)性，促使我們考慮到是否S1653S多態(tài)性在導致患者疾病表型中發(fā)揮作用，S1653S多態(tài)性是否修飾了V1951L通道的

23、生物學功能?我們設計了S1653S并V1951L(V1951L和S1653S)雙變異的SCN5A基因定點突變誘導進行生物學功能分析。十分有趣的是，V1951L和S1653S雙變異通道產(chǎn)生明顯的生物學功能改變，表現(xiàn)為通道電流密度顯著下降。這提示SCN5A基因S1653S多態(tài)性對V1951L突變的生物學功能產(chǎn)生了顯著的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，同時S1653S多態(tài)性也是疾病表型重要的基因修飾因子。因此，SCN5A基因V1951L和S1653S雙變異導致

24、鈉通道顯著的功能學改變，與V1951L和S1653S攜帶者明顯的致心律失常疾病表型相符合。有趣的是，這種現(xiàn)象與傳統(tǒng)的理論，即同義多態(tài)性由于沒有改變蛋白質最終的氨基酸序列而不會導致蛋白功能改變，不相符合。晚近研究證實了一種新理論，即同義多態(tài)性也可以導致蛋白功能顯著的改變。雖然確切的機制不清楚，需要未來的進一步研究，但本研究的結果確提供了很強的證據(jù)來支持這種全新的理論，即同義多態(tài)性可以改變蛋白質的功能而導致疾病發(fā)生。
　　 SCN5

25、A基因E428G突變、V1951L和S1553S雙變異均導致鈉通道產(chǎn)生顯著功能喪失作用，以及明顯的致心律失常表型-SQTS。這使得我們首次認識到鈉通道的功能喪失和SQTS的關聯(lián)。雖然SCN5A基因功能喪失突變導致SQTS的確切機制尚不清楚，但有以下證據(jù)支持：1.心肌細胞鈉通道功能喪失可以導致動作電位(action potential，AP)總的內(nèi)向離子電流減少，導致AP內(nèi)向離子流和外向離子流之間的平衡破壞，造成除極化儲備減少。如果復極化

26、速度不變，那么AP復極化時間將會減少，APD、ERP以及QT間期也會相應縮短。2.晚近基于人群大樣本的關聯(lián)研究證實QT間期與SCN5A基因變異有關。3.SCN5A基因功能喪失突變導致ⅠNa的降低，減慢了心臟電傳播速度，有助于折返激動波的維持，從而增加了室速/室顫的易感性。4.鈉通道和鈣通道均負責著AP內(nèi)向離子流。鈣通道的功能喪失和SQTS的相關性已經(jīng)得到證實。5.鈉通道和鈣通道的功能獲得均可導致LQTS。鈣通道的功能喪失導致了與LQTS

27、相反的表型-SQTS。6.最近，研究者開始認識到早期復極化綜合征患者中有很大一部分存在QT間期縮短，反義亦然。而SCN5A基因功能喪失突變和早期復極化的關系已經(jīng)證實。7。越來越多的證據(jù)表明BrS和SQTS是等位基因疾病。已經(jīng)證實SCN5A基因突變可以導致BrS。8.阻滯鈉通道可以縮短QT間期，加重BrS的ST段抬高程度，增加惡性心律失常發(fā)生風險。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)普羅帕酮能夠增加E428G通道電流，提示普羅帕酮對E428G通道造

28、成的功能喪失具有一定程度的改善作用，普羅帕酮可能是一個新的，有潛力的藥物來治療E428G突變所致SQTS。對于其它SCN5A突變引起的SQTS，普羅帕酮是否有效尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)普羅帕酮導致E428G通道的門控特性-電壓依賴的SSA與SSI曲線均顯著超極化方向轉移，提示SSI超極化方向轉移導致的鈉電流減少，可以被SSA超極化方向改變導致的鈉電流增加抵消。同時也提示普羅帕酮增加E428G突變鈉通道電流的作用，不是通過改變鈉通道SSA和S

29、SI而導致的。普羅帕酮增加E428G突變鈉通道電流的確切機制，目前尚不清楚。是否普羅帕酮也作用于E428G突變型鈉通道的失活相，以及普羅帕酮是如何對抗E428G突變導致的鈉電流減少，需要在未來研究中進一步闡明。
　　 總之，本研究首次報SCN5A基因功能喪失突變(E428G和R689H)導致SQTS一種新的亞型SQTS7。SCN5A基因同義多態(tài)性S1653S對V1951L突變的生物學功能具有明顯的協(xié)同作用，并導致鈉通道功能喪失。