1、一、目的 隨著冠脈介入術、搭橋術、經(jīng)皮穿刺冠狀動脈內(nèi)成形術、內(nèi)科溶栓等療法在冠心病患者中的廣泛應用，冠狀動脈再通后的再灌注損傷日益成為臨床上突出的問題。缺血后的再灌注損傷已經(jīng)成為阻礙缺血心肌從血液再灌注中獲得及時、有效療效的最大障礙。心律失常是缺血再灌注損傷最主要的臨床表現(xiàn)，有時嚴重的室性心律失常還危及生命。因此，探討缺血再灌注損傷心律失常的病理機制及研究有效的防治藥物意義重大。 中醫(yī)藥防治缺血再灌注心律失常具有多層次、

2、多角度、多靶點的特征，包括清除氧自由基、抑制鈣超載、對一氧化氮的影響、對交感神經(jīng)的影響等途徑。這充分顯示了中醫(yī)藥在防治缺血再灌注損傷及其心律失常方面有廣闊的前景。本研究采用大鼠冠狀動脈左前降支結(jié)扎再松開的方法復制缺血再灌注心律失常動物模型，用中藥復方定心方對其進行干預，研究定心方對缺血再灌注心律失常心肌細胞凋亡、心肌組織NF-κB和caspase-3表達的影響，同時利用蛋白質(zhì)組技術初步探討缺血再灌注心律失常動物模型的心肌蛋白質(zhì)組表達譜及

3、定心方對其的影響，以更深層次地揭示定心方防治缺血再灌注心律失常的機制，為研制開發(fā)防治缺血再灌注心律失常的有效藥物奠定基礎。 二、方法 雄性Wistar大鼠隨機分成3組，每組10只：假手術組(SH)、再灌注組(I/R)、定心方組(DXR)。在蛋白質(zhì)組實驗中DXR組根據(jù)有無出現(xiàn)心律失常又分為未出現(xiàn)心律失常組(DXRN)和出現(xiàn)心律失常組(DXRY)。所有動物均適應性喂養(yǎng)兩天。SH組大鼠每天分上午及下午兩次灌服生理鹽水，于第8天

4、進行假手術，即進行冠脈穿線但不結(jié)扎；I/R組大鼠亦分上午及下午兩次灌服生理鹽水，于第8天進行手術造模；DXR組大鼠分上午及下午兩次灌服制備好的定心方藥液，于第8天進行手術造模。灌胃量均按大鼠體重計算，每次1ml/100g。造模方法根據(jù)經(jīng)典的《藥理實驗方法學》“麻醉大鼠冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)心律失常法”，連接心電圖機和心電示波器，觀察心律失常的發(fā)生，詳細記錄再灌注期間的心律失常，并進行室性心律失常的量化評分。造模結(jié)束后直接取出心臟，放入冰生

5、理鹽水中沖洗，分離左心室部分，并將其再分成兩部分，一部分直接放入10％中性福爾馬林溶液中固定，一部分放入-80℃冰箱中保存。 福爾馬林溶液固定后的心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片。常規(guī)HE染色觀察缺血再灌注心律失常時的心肌組織形態(tài)及定心方對其的保護作用。采用TUNEL法檢測心肌細胞凋亡，觀察定心方對缺血再灌注心律失常心肌細胞凋亡的影響。采用SABC免疫組化法分別檢測心肌NF-κB、caspase-3的表達，觀察定心方對缺血再灌注心律失

6、常大鼠心肌NF-κ B、caspase-3表達的影響。 冰箱保存的心肌組織用組織裂解液提取心肌總蛋白，采用Bradford法進行心肌蛋白的定量。采用蛋白質(zhì)組最核心的雙向電泳技術分離心肌總蛋白，一向采用IPG3-10L、24cm凝膠條進行水平的等電聚焦，二向進行SDS-PAGE垂直電泳。電泳結(jié)束后采用硝酸銀染色法進行凝膠染色，利用凝膠成像儀采集圖像。采用Image MasterTM 2D platinum version5.0進行

7、圖像分析，包括蛋白點檢測、修正、背景消減、分子量和等電點的校正。以模型組心肌組織蛋白的凝膠圖像作為參考膠，其他各組與之匹配，采用軟件自動匹配并結(jié)合人工匹配方式進行。設定表達量相差2倍以上為差異表達范圍，軟件自動進行分析，給出差異表達蛋白質(zhì)點的數(shù)據(jù)信息。搜索網(wǎng)上RAT HEART-2DEPAGE數(shù)據(jù)庫的所有已鑒定蛋白點，與本實驗差異蛋白點進行對比分析(設定誤差范圍為：PI為±0.2，MW為±1kDa)，對本實驗的部分蛋白質(zhì)點進行初步的相似

8、性鑒定，為以后的質(zhì)譜鑒定提供參考。 三、結(jié)果 (一)定心方對缺血再灌注心律失常大鼠心律失常的影響。本實驗的造模方法可以較好地制作出心律失常模型，定心方對模型大鼠具有良好的保護作用。SH組大鼠偶見室性早搏，未見其他心律失常；I/R組大鼠10例均發(fā)生心律失常，以頻發(fā)室早、室速、室顫等為主，還有少量的房室傳導阻滯，其中2例因室顫死亡，室性心律失常評分與SH組比較增高；DXP組有7例出現(xiàn)心律失常，以室早和室速為主，室性心律失常評

9、分與I/P組相比降低。經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，各組心律失常發(fā)生率之間具有顯著性差異(P<0.05)；各組心律失常評分也具有顯著性差異(P<0.01)，其分值由高到低依次為I/R組、DXR組、SH組。 (二)定心方對缺血再灌注心律失常大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)有良好的保護作用。HE染色光鏡觀察見：SH組大鼠心肌細胞排列整齊，著色均勻，胞膜完整，無變性、壞死等改變；I/R組大鼠心肌細胞排列紊亂，著色不均勻，部分區(qū)域心肌細胞濁腫；DXR組大鼠亦有心肌細胞

10、變性與壞死改變，但程度較輕，著色相對均勻，水腫變性減輕，心肌壞死范圍較小。 (三)定心方對缺血再灌注心律失常大鼠心肌細胞凋亡的影響。SH組大鼠心肌組織有較少量的細胞凋亡。I/R組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)比SH組增高，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。DXR組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)比I/R組下降，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。 (四)定心方對缺血再灌注心律失常大鼠心肌組織caspase-3和NF-κB表達的影響。

11、SH大鼠心肌組織有較少量的caspase-3和NF-κB的表達。I/R組大鼠心肌組織中Caspase-3和NF-κB的表達比SH組顯著上調(diào)，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。DXR組大鼠心肌組織caspase-3和NF-κB的表達低于I/R組，兩組比較具有顯著性差異(P<0.01)。 (五)缺血再灌注心律失常大鼠心肌蛋白質(zhì)組表達譜及定心方對其的干預作用。各實驗組心肌蛋白質(zhì)組經(jīng)雙向凝膠電泳及銀染后能獲得751±36個蛋白點，

12、大多數(shù)蛋白點集中在PH4-7和分子量20-80KD之間的區(qū)域。以I/R組為參考，各組與之匹配，匹配率為81％±4.3％。圖像分析后可發(fā)現(xiàn)部分蛋白質(zhì)在動物造模及定心方作用后發(fā)生了明顯的質(zhì)或量的改變。其中，SH組與I/R組比較，共有33個蛋白點變化；DXRN組與I/R組比較，共有36個蛋白點變化；DXRY組與I/R組比較，共有11個蛋白點變化。搜索網(wǎng)上RAT HEART-2DEPAGE數(shù)據(jù)庫的所有已鑒定蛋白點，與本實驗差異蛋白點進行對比分析

13、(設定誤差范圍為：PI為±0.2，M1W為±1kDa)，經(jīng)相似性搜索，初步鑒定了5個蛋白點。SSP1833、SSP2079、SSP2211、SSP545、SSP1766分別為Fructose-bisphosphate aldolase(果糖二磷酸醛縮酶)、ATP synthase alpha chain(ATP合酶α鏈)、Creatine kinase Mchain(肌酸激酶M鏈)、Myosin heavy chainl(肌球蛋白重鏈1

14、)、Alpha-actin 2(α-肌動蛋白2)。以上這些差異蛋白質(zhì)點可能在缺血再灌注心律失常發(fā)生及定心方防治過程中具有重要的意義。 四、結(jié)論 (一)大鼠缺血再灌注損傷容易誘發(fā)心律失常，定心方可以明顯減少心律失常的發(fā)生率，減輕心律失常發(fā)生的嚴重程度。 (二)定心方對大鼠心肌缺血再灌注心律失常心肌組織結(jié)構(gòu)具有良好的保護作用。 (三)大鼠心肌缺血再灌注心律失常時心肌細胞凋亡明顯增加，定心方可以減少心肌細胞凋