1、研究背景：
　　 2006年科學家發(fā)現(xiàn)可以通過轉(zhuǎn)導4個基因?qū)⑿∈蟮钠つw細胞重編碼為具有胚胎干細胞功能的干細胞，他們將這種細胞命名為誘導型多潛能干細胞(Induced Pluripotent stem Cells，iPS cells)。2009年中國科學家證實將iPS細胞植入四倍體囊胚，可以發(fā)育成小鼠活體，充分證明了iPS同胚胎干細胞功能上對等具有多能性(Pluripotent)，是一種全新的多潛能干細胞。iPS細胞同胚胎干細胞相

2、似具有2大特點：即在體外能夠無限自我更新和多能性(在適宜的條件下能夠分化為機體3個胚層的所有細胞)，能夠為人工肝，肝臟細胞移植和肝臟組織工程提供種子細胞。iPS細胞不需要破壞胚胎沒有倫理壓力和同時這些多潛能性干細胞來自病人本身沒有HLA不匹配的問題，不存在免疫排斥的問題，所以iPS細胞是臨床肝細胞非常理想的來源，使得肝病個體化研究和治療有望成為現(xiàn)實。但是iPS細胞本身不具備肝細胞的功能，而且如果直接注入機體會產(chǎn)生畸胎瘤，在應(yīng)用于治療之前

3、必需先將其分化為功能性細胞。所以探討如何在體外使iPS細胞遵循正常肝臟胚胎發(fā)育通路定向分化為肝細胞是一項重要的工作。
　　 目的：
　　 探討如何誘導小鼠iPS細胞遵循肝臟發(fā)育途徑分化為具有合成、代謝、分泌及儲存功能的肝細胞并探討iPS來源確定性內(nèi)胚層細胞(Definitive Endoderm，DE)和肝細胞體內(nèi)移植可行性、效果和生物安全性。
　　 方法：
　　 1.設(shè)計全新的2步誘導法，首先iPS細胞

4、誘導分化為ADE，再繼續(xù)誘導分化為肝細胞。第一步在單層和無血清的培養(yǎng)條件下，分2個階段序貫加入活化素A(ActinvinA)，骨形態(tài)蛋白4(BMP4)，基本纖維細胞生長因子(Basic fibroblastgrowth factor，bFGF)，表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)，序貫激活和協(xié)調(diào)Nodal信號和FGF信號轉(zhuǎn)導通路，促使iPS細胞誘導分化為DE細胞。
　　 2.第二步在建立DE細

5、胞的基礎(chǔ)上再次分2個階段先加入BMP4和肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，誘導DE細胞向肝細胞方向分化，在使用肝細胞專用培養(yǎng)基，加入HGF，腫瘤抑制因子(Oncostatin M,OSM)等生長因子使分化的IPS細胞進一步分化為成熟的肝細胞。3.應(yīng)用Realtime RT-PCR細胞免疫熒光和流式細胞儀等方法從細胞形態(tài)，各階段特色基因mRNA，各階段特異性蛋白表達和各種肝細胞特異性功能檢測4個層

6、次對IPS來源的DE細胞和肝細胞進行鑒定。4.在建立小鼠肝急性肝損傷模型的基礎(chǔ)上，采用性別差異性細胞移植，將雄性iPS來源ADE細胞和雄性iPS來源肝細胞通過門靜脈移植到受損的肝臟，來觀察這些分化的細胞能否在體內(nèi)繼續(xù)向肝臟細胞分化或維持肝細胞表型，同時評估iPS細胞治療的生物安全性。
　　 結(jié)果：
　　 1.iPS細胞在分化的第6天，形態(tài)上由典型的iPS細胞克隆即細胞排列緊密，細胞之間界限不清逐步轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎帕兴缮?，細?/p>

7、之間界限分明并呈現(xiàn)內(nèi)皮樣細胞狀態(tài)；在mRNA水平，分化的過程中多潛能性基因如OCT4，Nanog表達逐漸下調(diào)，而DE特色基因如CXCR4，E-Cadherin,Sox17,FoxA2表達逐漸升高；同基因表達結(jié)果一致，在蛋白水平免疫熒光顯示在分化的第6天，DE標志性轉(zhuǎn)錄因子Sox17和FoxA2明顯高表達，同時90％的Sox17的陽性細胞同時表達FoxA2，流式細胞儀的檢測提示在分化的第6天，DE細胞表面標記CXCR4表達可達85％，同時

8、CXCR4+C-Kit或CXCR4+E-Cadherin雙陽性細胞在分化的第6天達到約80％。2.在分化的第20天，分化細胞呈現(xiàn)多角形內(nèi)皮細胞樣形態(tài)，胞漿里出現(xiàn)糖原顆粒等肝細胞特色形態(tài)；分化的各時間段實時定量RT-PCR檢測顯示：在mRNA表達的水平，IPS細胞經(jīng)歷了肝細胞在體內(nèi)從胚胎干細胞的發(fā)育過程，而早期肝細胞特異性mRNA表達如HNF4和AFP在分化的中期開始升高，肝細胞成熟特異性RNA如Albumin,TAT,CYP7Al,CF

9、Ⅶ和Asgpr-1在分化的晚期才達高峰，同時AFP基因的表達較中期明顯下調(diào)。同mRNA表達一致，在分化的第20天，免疫熒光實驗提示大部分的肝臟細胞表達AFP，Albumin(陽性率80％)；流式細胞儀檢測提示成熟肝細胞表面標志唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoproteinreceptor-1,Asgpr-1)(陽性率42.7％)。更為重要的是這些iPS來源肝細胞在體外具有典型成熟肝細胞的功能，能夠攝取LDL,具備攝取和排出ICG

10、能力，可以儲存糖原，并能夠分泌AFP，Albumin等蛋白和尿素。尤為重要的是這些iPS來源的肝細胞樣細胞具有藥物代謝酶細胞色素P450酶的活性。3.在移植DE細胞后的1周在雌性受體的肝臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Y染色體陽性細胞，這些細胞呈條索狀，較移植后的第一天明顯增生，同時大部分的Y染色體陽性的表達肝細胞特異性蛋白CYP2D6，提示這些D E細胞能夠在體內(nèi)繼續(xù)分化為肝細胞。同時在iPS細胞來源的肝細胞移植后的1周我們同樣發(fā)現(xiàn)了較大量的條索狀Y染色體

11、陽性細胞，大部分的細胞同時表達肝細胞特異性蛋白CYP2D6，提示本研究產(chǎn)生的iPS來源性肝細胞能夠在受損的肝臟內(nèi)存活并保持肝細胞的表型。然而在移植D E細胞的第6周我們發(fā)現(xiàn)受體的肝臟中出現(xiàn)了畸胎瘤。
　　 結(jié)論：
　　 1.iPS細胞能夠在無血清單層培養(yǎng)的條件下，遵循體內(nèi)肝臟胚胎早期發(fā)育的途徑，定向分化為DE細胞。2.DE細胞能夠進一步遵循肝臟發(fā)育的路徑定向分化為肝細胞，具備具有合成、代謝、分泌及儲存功能，并有藥物代謝酶