1、對于外周血干細胞移植支持下大劑量化療治療的實體瘤患者,治療后免疫功能重建并清除殘留病灶是關(guān)鍵問題.根據(jù)早期的文獻,通過表達Fas配體對Fas介導(dǎo)凋亡途徑的抵抗可能會使多種腫瘤對機體免疫系統(tǒng)進行優(yōu)先攻擊或反擊.從概念上講,消除腫瘤的Fas反擊(counterattack)是腫瘤免疫治療的一個令人興奮的有效目標(biāo).我們將把表達Fas的T淋巴細胞和表達FasL的腫瘤細胞的體外相互作用作為該項目的研究對象,利用反義FasL核酸技術(shù)拮抗腫瘤細胞的F

2、asL表達或功能,以達到消除腫瘤的Fas反擊并延長TIL壽命的目的,這將最終促進免疫功能重建,從而提高抗腫瘤的效果.第一部分:腫瘤細胞逃逸Fas系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫殺傷的研究;為研究結(jié)腸腫瘤細胞系表達FasL逃逸免疫監(jiān)視的可能,研究中采用了敏感的免疫組織化學(xué)SABC法觀察結(jié)腸癌細胞系和Jurkat T淋巴細胞系Fas與FasL的表達,為癌細胞的Fas和FasL的功能提供形態(tài)學(xué)依據(jù).第二部分:人FasL反義真核表達載體的構(gòu)建和鑒定;為了研究抑制

3、腫瘤的Fas反擊(conterattack)的可行性,一種新的重組真核表達載體pcDNA3.1-hFL-AS被構(gòu)建.將人FasL cDNA亞克隆入人巨細胞病毒(CMV)啟動子控制基因表達質(zhì)粒pcDNA3.1 XbaⅠ位點構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1-hFL-AS.pcDNA3.1-hFL -AS酶切鑒定結(jié)果顯示分別為1.85kb和4.55kb片段.基因序列分析確定人FasL cDNA被正確插入載體,證實核苷酸序列正確.重組真核表達載